| 货号：UPLC-MS-4443 | 规格：100T/96S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4442 | 规格：50T/48S |
紫外分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
溶液的配制：工作液的配制：在试剂二中加入19mL试剂一充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min。
GDH（EC 1.4.1.2）广泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。
GDH催化NH +、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD+，引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率，计算GDH活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。
2、称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=643×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=643×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=1.286×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样： 加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
b. 用96孔UV板测定的计算公式如下
4. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=1072×ΔA÷Cpr
5．按样本质量计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1072×ΔA÷W
6．按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=2.144×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
1、当ΔA大于0.5时，将样本进行稀释后测量。
2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
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