谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测试剂盒-谷氨酸合成酶(GOGAT)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4451 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4450 规格:50T/48S 紫外分光光度法
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 100 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 20 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×2

4℃保存

试剂三

粉剂×2

4℃保存

试剂四

粉剂×2

-20℃保存

溶液的配制:

1 工作液的配制:取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入 10 mL 试剂一中溶解,现用现配,可分装后-20℃保存,避免反复冻融。

产品说明:

GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中,和谷氨酰胺合成酶(GS)共同构成 GS/GOGAT 循环,参与氨同化的调控。GOGAT  NADH 为电子供体,催化谷氨酰胺的氨基转移到 α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸,NADH  340nm

吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20% 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,分光光度计蒸馏水调零。

2 工作液提前配置,平衡至室温。

3 样本测定:

试剂名称(μL

测定管

工作液

180

样本

20

在微量石英比色皿或者 96 UV 板中混匀,加样本的同时开始计时,在 340 nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1,比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 25℃水浴或培养箱中准确反应 5 分钟若酶标仪带有控温功能,将温度调至 25℃);迅速取出比色皿并擦干,340nm 下比色,记录 5 20 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2

三、GOGAT 活性计算

       1 按微量石英比色皿计算:

        (1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。GOGAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

(2) 按样本质量计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。GOGAT(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.5×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。GOGAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.643×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万;109:单位换算系数,1mol =109nmol。

2 96 UV 板计算:

将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 UV 板光径)进行计算即可。

注意事项:

1、测定期间样本在冰上放置,以免变性和失活。

2、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

3、当 A1 大于 1.5 或者 ΔA 大于 0.6(酶标仪 ΔA 大于 0.4)时,建议将样本用蒸馏水稀释后测定,当 ΔA 过小时, 可以延长酶促反应时间(10min 15min)或者加大加入的样本体积进行测量。

4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。


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