辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒-辅酶Ⅰ NAD(H)检测试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4339 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4338 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

酸性提取液

液体 25 mL×1

4℃保存

碱性提取液

液体 25 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 5 mL×1

4℃保存

试剂二

液体 1.5 mL×1

4℃保存

试剂三

液体 4mL×1

4℃保存

试剂四

液体 0.7 mL×1

-20℃保存

试剂五

液体 15 mL×1

4℃保存

试剂六

液体 20 mL×1 瓶(自备)

常温保存

NAD 标准品

粉剂×1

-20℃保存

NADH 标准品

粉剂×1

-20℃保存

溶液的配制:

1、试剂三:需要严格避光;

2、试剂六:19.2 mL 乙醇和 0.8 mL 蒸馏水混合,备用;

3、NAD 标准品:临用前加入 1.5 mL 蒸馏水,即 2 µmol/mL,将其稀释为 1.25 nmol/mL NAD 标准溶液备用;

4、NADH 标准品:临用前加入 1.4 mL 蒸馏水,即 2 µmol/mL,将其稀释为 1.25 nmol/mL NADH 标准溶液备用。

产品说明:

辅酶 I 包括还原型和氧化型两种形式,在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶 I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是脱氢酶的辅酶,它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给 NAD,使之成为 NADH(还原型辅酶 I)。而 NADH 则会作为氢的载体,在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式,合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义,与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶 I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。

分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD+和NADH,NADH 通过PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值,而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一步采用 MTT 还原法检测。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、NAD+ NADH 的提取(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、血清(浆)中 NAD+ NADH 的提取:

NAD+的提取:取 0.1mL 血清(浆),加入 0.5mL 酸性提取液,煮沸 5min (盖紧,以防止水分散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取上清 200μL,加入等体积碱性提取液;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上保存待测。

NADH 的提取:取 0.1mL 血清(浆),加入 0.5mL 碱性提取液,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200μL,加入等体积酸性提取液;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上保存待测。

2、组织中 NAD+ NADH 的提取:

NAD+的提取:称取约 0.1g 组织,加入 0.5mL 酸性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失) 冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200μL,加入等体积碱性提取液混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上保存待测。

NADH 的提取:称取约 0.1g 组织,加入 0.5mL 碱性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失) 冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200μL,加入等体积酸性提取液混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上保存待测。

3、细胞或细菌中 NAD+ NADH 的提取:

NAD+的提取:收集 500 万细胞或细菌,加入 0.5mL 酸性提取液,超声波破碎 1min(强度 20%或 200W,超 2s,停 1s),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4 离心 10min,取上清液 200μL 至另一新的离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。

NADH 的提取:收集 500 万细胞或细菌,加入 0.5mL 碱性提取液,超声波破碎 1min(强度 20%或 200W,超 2s,停 1s),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4 离心 10min,取上清液 200μL 至另一新的离心管中,加入等体积的酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。

二、测定步骤

1 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。

2 操作表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样)

三、NAD+含量的计算

1、血清(浆)中 NAD+含量计算:NAD+含量(nmol/mL)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 

2、组织、细菌、细胞中 NAD+含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算:NAD+ (nmol/mg prot)=ΔA 测定÷( ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷(V 提取×Cpr)= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 ÷Cpr

(2) 按样本质量计算:

NAD+ (nmol/g 质量)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷W= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W (3)按细菌或细胞数量计算

NAD+ (nmol/104 cell)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 1

四、NADH 含量的计算

1 血清(浆)中 NADH 含量计算:NADH 含量(nmol/mL)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2

 2、组织中 NADH 含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算:NADH (nmol/mg prot)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷(V 提取×Cpr)= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 ÷Cpr

(2) 按样本质量计算:NADH (nmol/g  质量)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷W=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W

(3) 按细菌或细胞数量计算:

NADH (nmol/104 cell)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 2

C 标:NAD 或NADH 标准溶液的浓度,1.25nmol/mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;V 提取:加入提取液总体积,1mL V 血清:提取时加入的血清体积,0.1mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞数量,500 万。

注意事项:

1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三混合后再加,必须分开加。

2、反应过程要注意避光。

3、当吸光值大于 1 时,建议稀释后测量。


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