上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、试剂三：需要严格避光；

2、试剂六：19.2 mL 乙醇和 0.8 mL 蒸馏水混合，备用；

3、NAD 标准品：临用前加入 1.5 mL 蒸馏水，即 2 µmol/mL，将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用；

4、NADH 标准品：临用前加入 1.4 mL 蒸馏水，即 2 µmol/mL，将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。

产品说明：

辅酶 I 包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶 I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给 NAD，使之成为 NADH（还原型辅酶 I）。而 NADH 则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶 I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。

分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD+和NADH，NADH 通过PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值，而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、NAD+和 NADH 的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 酸性提取液，煮沸 5min (盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min；取上清 200μL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清， 冰上保存待测。

NADH 的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 碱性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200μL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清， 冰上保存待测。

2、组织中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)， 冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200μL，加入等体积碱性提取液混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清， 冰上保存待测。

NADH 的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)， 冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200μL，加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清， 冰上保存待测。

3、细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 酸性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200μL 至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上保存待测。

NADH 的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 碱性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200μL 至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上保存待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、 操作表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）

三、NAD+含量的计算

1、血清（浆）中 NAD+含量计算：NAD+含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 

2、组织、细菌、细胞中 NAD+含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算：NAD+ (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷(V 提取×Cpr)= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 ÷Cpr

(2) 按样本质量计算：

NAD+ (nmol/g 质量）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷W= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W (3)按细菌或细胞数量计算

NAD+ (nmol/104 cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 1

四、NADH 含量的计算

1、 血清（浆）中 NADH 含量计算：NADH 含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2

 2、组织中 NADH 含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算：NADH (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷(V 提取×Cpr)= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 ÷Cpr

(2) 按样本质量计算：NADH (nmol/g  质量）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷W=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W

(3) 按细菌或细胞数量计算：

NADH (nmol/104 cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 2

C 标：NAD 或NADH 标准溶液的浓度，1.25nmol/mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V 提取：加入提取液总体积，1mL； V 血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞数量，500 万。

注意事项：

1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三混合后再加，必须分开加。

2、反应过程要注意避光。

3、当吸光值大于 1 时，建议稀释后测量。