辅酶 II NADP(H)含量检测试剂盒(WST 显色法)-辅酶 II NADP(H)检测试剂盒(WST 显色法)-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号:UPLC-MS-6010 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-6009 规格:50T/24S 可见分光光度法
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

酸性提取液

液体 15 mL×1

2-8℃保存

碱性提取液

液体 15mL×1

2-8℃保存

试剂一

液体 30 mL×1

2-8℃保存

试剂二

粉剂×1

-20℃保存

试剂三

液体 12mL×1

2-8℃保存

试剂四 A

粉剂×1

-20℃保存

试剂四 B

液体 10mL×1

2-8℃保存

试剂五

液体 70 mL×1

2-8℃保存

NADP 标准品

粉剂×1

-20℃保存

NADPH 标准品

粉剂×1

-20℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前加入 12mL 蒸馏水充分混匀,溶解后 2-8℃保存 4 周。

2 试剂四:临用前将试剂四 A 溶解到试剂四 B 中,分装保存,避免反复冻融,-20℃保存 4 周。

3 NADP 标准品:临用前加入 1.27 mL  蒸馏水,即 5 µmol/mL,-20℃可以保存 2 周。

4 NADPH 标准品:临用前加入 1.2 mL 蒸馏水,即 5 µmol/mL,-20℃可以保存 2 周。

产品说明:

辅酶Ⅱ NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+ NADPH  含量测定可以计算NADP(NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+ NADPH。在 1-mPMS 作用下,WST-1 可与 NADPH 反应,产生水溶性 formazan,在 450nm 下有特征吸收峰,而 NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH,进一步采用

WST-1 检测。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅,研钵/匀浆器、超声破碎仪,可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、血清(浆)中 NADP+ NADPH 的提取:

NADP+的提取:取血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL) 1:5-10 的比例,(建议取 0.1mL 血清(血浆),加入 0.5 mL 酸性提取液),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 碱性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上待测。

NADPH 的提取:取血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL) 1:5-10 的比例,(建议取 0.1mL 血清(血浆),加入 0.5 mL 碱性提取液),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 酸性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上待测。

2、组织中 NADP+ NADPH 的提取:

NADP+的提取:建议取 0.1g 组织质量,加入 0.5mL 酸性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 碱性提取液使之中和;混匀, 10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。

NADPH 的提取:建议取 0.1 g 组织质量,加入 0.5 mL 碱性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 酸性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。

3、细胞或细菌中 NADP+ NADPH 的提取:

NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,离心弃上清,建议 500 万细胞或者细菌加入 0.5mL 酸性提取液,超声波破碎(冰浴,功率 200W,超声 3s,停 10s,重复 30 次),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失) 冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 碱性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。

NADPH 的提取:建议 500 万细胞或者细菌加入 0.5mL 碱性提取液,超声波破碎(冰浴,功率 200W 超声 3s,停 10s,重复 30 次),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min 200μL 上清液,加入 200μL 酸性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测

二、测定步骤

1 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 450nm,蒸馏水调零。

2 NADP+标准品:用蒸馏水稀释为 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0nmol/mL的标准溶液(0nmol/mL 即空白管)。

3 NADPH 标准品:用蒸馏水稀释为 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0nmol/mL 的标准溶液(0nmol/mL 即空白管)。

三、NADP+ NADPH 含量计算

1、标准曲线绘制:

(1) NADP+标准曲线的绘制:根据标准管的浓度(x1,nmol/mL)和吸光度ΔA标准(y1,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA      测定代入方程得到x1(nmol/mL)。

(2) NADPH标准曲线的绘制:根据标准管的浓度(x2,nmol/mL)和吸光度ΔA标准(y2,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA´ 代入方程得到x2(nmol/mL)。

2、NADP+和NADPH含量计算

(一)NADP+含量计算

(1) 按液体体积计算:NADP+含量(nmol/mL)= x1×(V 提取+V 血清)÷V 血清=11×x1

(2) 按样本蛋白浓度计算 NADP+ (nmol/mg prot)= x1×V 提取÷(V 提取×Cpr)= x1 ÷ Cpr

(3) 按样本鲜重计算 NADP+含量(nmol/g 质量)= x1×V 提取÷W= x1÷W

(4) 按细胞数量计算:NADP+含量(nmol/104 cell)= x1×V 提取÷500=0.002×x1

(二)NADPH 含量计算

(1) 按液体体积计算:NADPH 含量(nmol/mL)= x2×(V 提取+V 血清)÷V 血清=11×x2

(2) 按样本蛋白浓度计算 NADPH (nmol/mg prot)= x2×V 提取÷(V 提取×Cpr)= x2 ÷ Cpr

(3) 按样本鲜重计算 NADPH 含量(nmol/g  质量)= x2×V 提取÷W= x2÷W

(4) 按细胞数量计算:NADPH 含量(nmol/104 cell)= x2×V 提取÷500=0.002×x2

V提取:加入提取液体积,1mL;V血清:血清(浆)体积,0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项:

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三按比例配成混合液。

2、反应过程中注意避光。

3、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 50 管可以测定 24 NADP+ NADPH。

4、如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。同步修改计算公式。


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