上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-6010	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-6009	规格：50T/24S	可见分光光度法

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 12mL 蒸馏水充分混匀，溶解后 2-8℃保存 4 周。

2、 试剂四：临用前将试剂四 A 溶解到试剂四 B 中，分装保存，避免反复冻融，-20℃保存 4 周。

3、 NADP 标准品：临用前加入 1.27 mL  蒸馏水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存 2 周。

4、 NADPH 标准品：临用前加入 1.2 mL 蒸馏水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存 2 周。

产品说明：

辅酶Ⅱ NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH  含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。在 1-mPMS 作用下，WST-1 可与 NADPH 反应，产生水溶性 formazan，在 450nm 下有特征吸收峰，而 NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH，进一步采用

WST-1 检测。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅，研钵/匀浆器、超声破碎仪，可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中 NADP+和 NADPH 的提取：

NADP+的提取：取血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例，（建议取 0.1mL 血清（血浆），加入 0.5 mL 酸性提取液），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清, 冰上待测。

NADPH 的提取：取血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例，（建议取 0.1mL 血清（血浆），加入 0.5 mL 碱性提取液），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清, 冰上待测。

2、组织中 NADP+和 NADPH 的提取：

NADP+的提取：建议取 0.1g 组织质量，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 碱性提取液使之中和；混匀， 10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

NADPH 的提取：建议取 0.1 g 组织质量，加入 0.5 mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

3、细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取：

NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，离心弃上清，建议 500 万细胞或者细菌加入 0.5mL 酸性提取液，超声波破碎（冰浴，功率 200W，超声 3s，停 10s，重复 30 次），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)， 冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

NADPH 的提取：建议 500 万细胞或者细菌加入 0.5mL 碱性提取液，超声波破碎（冰浴，功率 200W， 超声 3s，停 10s，重复 30 次），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min； 取 200μL 上清液，加入 200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。

2、 NADP+标准品：用蒸馏水稀释为 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0nmol/mL的标准溶液（0nmol/mL 即空白管）。

3、 NADPH 标准品：用蒸馏水稀释为 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0nmol/mL 的标准溶液（0nmol/mL 即空白管）。