辅酶 II NADP(H)含量检测试剂盒(MTT 显色法)-辅酶 II NADP(H)检测试剂盒(MTT 显色法)-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4371 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4370 规格:50T/24S 可见分光光度法
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

酸性提取液

液体 25 mL×1

2-8℃保存

碱性提取液

液体 25 mL×1

2-8℃保存

试剂一

液体 10 mL×1

2-8℃保存

试剂二

粉剂×1

-20℃保存

试剂三

液体 8mL×1

2-8℃保存

试剂四 A

粉剂×1

-20℃保存

试剂四 B

液体 5mL×1

2-8℃保存

试剂五

液体 30 mL×1

2-8℃保存

试剂六

液体 50 mL×1

2-8℃保存

NADP 标准品

粉剂×1

-20℃保存

NADPH 标准品

粉剂×1

-20℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前加入 4mL 蒸馏水充分混匀,溶解后 4℃保存 2-8 周。

2 试剂四:临用前将试剂四 A 溶解到试剂四 B 中,溶解后加入 5mL 蒸馏水,分装保存,避免反复冻融,-20℃ 保存 4 周。

3 NADP 标准品:临用前加入 1.27 mL  蒸馏水,即 5 µmol/mL,-20℃可以保存 2 周。

4 NADPH 标准品:临用前加入 1.2 mL 蒸馏水,即 5 µmol/mL,-20℃可以保存 2 周。

产品说明:

辅酶Ⅱ NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+ NADPH  含量测定可以计算NADP(NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为NADPH,从而检测 NADP+含量。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、超声破碎仪、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、血清(浆)中 NADP+ NADPH 的提取:

NADP+的提取:取 0.1mL 血清(浆),加入 0.5mL 酸性提取液,煮沸 5min (盖紧,以防止水分散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取上清 200µL,加入等体积碱性提取液;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上保存待测。

NADPH 的提取:取 0.1mL 血清(浆),加入 0.5mL 碱性提取液,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200µL,加入等体积酸性提取液;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上保存待测。

2、组织中 NADP+ NADPH 的提取:

NADP+的提取:称取约 0.1g 组织,加入 0.5mL 酸性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失) 冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200µL,加入等体积碱性提取液混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上保存待测。

NADPH 的提取:称取约 0.1g 组织,加入 0.5mL 碱性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失) 冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200µL,加入等体积酸性提取液混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清, 冰上保存待测。

3、细胞或细菌中 NADP+ NADPH 的提取:

NADP+的提取:收集 500 万细胞或细菌,加入 0.5mL 酸性提取液,超声波破碎 1min(强度 20%或 200W,超 2s,停 1s),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4 离心 10min,取上清液 200uL 至另一新的离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。

NADPH 的提取:收集 500 万细胞或细菌,加入 0.5mL 碱性提取液,超声波破碎 1min(强度 20%或 200W 超声 2s,停 1s),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4 离心 10min,取上清液 200uL 至另一新的离心管中,加入等体积的酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。

二、测定步骤

1 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 570 nm,分光光度计蒸馏水调零。

2 NADP 标准品:用蒸馏水稀释为 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0nmol/mL 的标准溶液(0nmol/mL即空白管)。

3 NADPH 标准品:用蒸馏水稀释为 1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0nmol/mL 的标准溶液(0nmol/mL即空白管)。

4 稀释表(附于说明书最后)

三、NADP+ NADPH 含量计算

1、标准曲线绘制:

(1) NADP+标准曲线的绘制:根据标准管的浓度(x1,nmol/mL)和吸光度ΔA标准(y1,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA代入方程得到x1(nmol/mL)。

(2) NADPH标准曲线的绘制:根据标准管的浓度(x2,nmol/mL)和吸光度ΔA标准(y2,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA代入方程得到x2(nmol/mL)。

2、NADP+和NADPH含量计算

(一)NADP+含量计算

(1) 按液体体积计算:NADP+含量(nmol/mL)= x1×(V 提取+V 血清)÷V 血清=11×x1

(2) 按样本蛋白浓度计算 NADP+ (nmol/mg prot)= x1×V 提取÷(V 提取×Cpr)= x1 ÷ Cpr

(3) 按样本鲜重计算 NADP+含量(nmol/g 鲜重)= x1×V 提取÷W= x1÷W

(4) 按细胞数量计算:NADP+含量(nmol/104 cell)= x1×V 提取÷500=0.002×x1

(二)NADPH 含量计算

(1) 按液体体积计算:NADPH 含量(nmol/mL)= x2×(V 提取+V 血清)÷V 血清=11×x2

(2) 按样本蛋白浓度计算 NADPH (nmol/mg prot)= x2×V 提取÷(V 提取×Cpr)= x2 ÷ Cpr

(3) 按样本鲜重计算 NADPH 含量(nmol/g  鲜重)= x2×V 提取÷W= x2÷W

(4) 按细胞数量计算:NADPH 含量(nmol/104 cell)= x2×V 提取÷500=0.002×x2

V提取:加入提取液体积,1mL;V血清:血清(浆)体积,0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项:

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三按比例配成混合液。

2、反应过程中注意避光。

3、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管可以测定 48 NADP+ NADPH。

4、如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。


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