上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
| 货号：UPLC-MS-4371 | 规格：100T/48S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4370 | 规格：50T/24S |
可见分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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酸性提取液 |
液体 25 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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碱性提取液 |
液体 25 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂一 |
液体 10 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂二 |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
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试剂三 |
液体 8mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂四 A |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
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试剂四 B |
液体 5mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂五 |
液体 30 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂六 |
液体 50 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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NADP 标准品 |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
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NADPH 标准品 |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入 4mL 蒸馏水充分混匀，溶解后 4℃保存 2-8 周。
2、 试剂四：临用前将试剂四 A 溶解到试剂四 B 中，溶解后加入 5mL 蒸馏水，分装保存，避免反复冻融，-20℃ 保存 4 周。
3、 NADP 标准品：临用前加入 1.27 mL 蒸馏水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存 2 周。
4、 NADPH 标准品：临用前加入 1.2 mL 蒸馏水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存 2 周。
辅酶Ⅱ NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为NADPH，从而检测 NADP+含量。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、超声破碎仪、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、血清（浆）中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 酸性提取液，煮沸 5min (盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min；取上清 200µL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清， 冰上保存待测。
NADPH 的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 碱性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200µL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清, 冰上保存待测。
2、组织中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)， 冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200µL，加入等体积碱性提取液混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清, 冰上保存待测。
NADPH 的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)， 冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200µL，加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清, 冰上保存待测。
3、细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 酸性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上保存待测。
NADPH 的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 碱性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％或 200W， 超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上保存待测。
1、 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 570 nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、 NADP 标准品：用蒸馏水稀释为 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0nmol/mL 的标准溶液（0nmol/mL即空白管）。
3、 NADPH 标准品：用蒸馏水稀释为 1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0nmol/mL 的标准溶液（0nmol/mL即空白管）。
4、 稀释表（附于说明书最后）
1、标准曲线绘制：
（1） NADP+标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（x1，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y1，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA代入方程得到x1（nmol/mL）。
（2） NADPH标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（x2，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y2，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA代入方程得到x2（nmol/mL）。
2、NADP+和NADPH含量计算
V提取：加入提取液体积，1mL；V血清：血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三按比例配成混合液。
2、反应过程中注意避光。
3、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管可以测定 48 个 NADP+或 NADPH。
4、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到
