上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：1、 NAD 标准品：临用前加入 1.5 mL 蒸馏水，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存 2 周。

                   2、 NADH 标准品：临用前加入 1.4 mL  蒸馏水，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存 2 周。

产品说明：

辅酶 I 包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶 I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给 NAD，使之成为 NADH（还原型辅酶 I）。而 NADH 则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶 I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。

分别用酸性和碱性提取液提取样本中 NAD+和 NADH，在 1-mPMS 作用下，WST-1 可与 NADH 反应，产生水溶性 formazan，在 450nm 下有特征吸收峰，而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 WST-1 检测。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅，研钵/匀浆器、超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：建议取 0.1mL 血清（血浆），加入 0.5mL 酸性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)； 冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

NADH 的提取：建议取 0.1mL 血清（血浆），加入 0.5 mL 碱性提取液，煮沸 5min (盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

2、组织中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：建议取 0.1g 组织质量，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min (盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 碱性提取液使之中和；混匀， 10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

NADH 的提取：建议取 0.1 g 组织质量，加入 0.5 mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min (盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

3、细胞或细菌中 NAD+  和 NADH 的提取：

NAD+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，离心弃上清，建议 500 万细胞或者细菌加入 0.5mL 酸性提取液，超声波破碎（冰浴，功率 200W，超声 3s，停 10s，重复 30 次），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，； 冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入 200μL 碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

NADH 的提取：建议 500 万细胞或者细菌加入 0.5mL 碱性提取液，超声波破碎（冰浴，功率 200W，超声 3s，停 10s，重复 30 次），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心 10min； 取 200μL 上清液，加入 200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 450 nm，蒸馏水调零。

2、 NAD 标准品：用蒸馏水稀释为 0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.019、0nmol/mL 的标准溶液。0nmol/mL 即为空白管（A _空）。

3、 NADH 标准品：用蒸馏水稀释为 0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.019、0nmol/mL 的标准溶液。0nmol/mL即为空白管（A _空）。

三、NAD+和 NADH 含量计算

1、标准曲线绘制：

        （1） NAD标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y₁，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA      测定代入方程得到x₁（nmol/mL）。

（2） NADH标准曲线的绘制根据标准管的浓度（x₂，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y₂，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA´ 代入方程得到x₂（nmol/mL）。

2、NAD+和NADH含量计算

（一）NAD+含量计算

（1） 按液体体积计算：NAD+含量(nmol/mL）= x₁×（V 提取+V 血清）÷V 血清=11×x₁

（2） 按样本蛋白浓度计算 NAD+ (nmol/mg prot）= x₁×V 提取÷(V 提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按样本鲜重计算 NAD+含量(nmol/g 质量）= x₁×V 提取÷W= x₁÷W

（4） 按细胞数量计算：NAD+含量(nmol/104 cell）= x₁×V 提取÷500=0.002×x₁

（二）NADH 含量计算

（1） 按液体体积计算：NADH 含量(nmol/mL）= x₂×（V 提取+V 血清）÷V 血清=11×x₂

（2） 按样本蛋白浓度计算 NADH (nmol/mg prot）= x₂×V 提取÷(V 提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按样本鲜重计算 NADH 含量(nmol/g  质量）= x₂×V 提取÷W= x₂÷W