货号:UPLC-MS-6008 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-6007 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
酸性提取液 |
液体 15 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
碱性提取液 |
液体 15 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂二 |
液体 6 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂三 |
液体 12mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂四 |
液体 3mL×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂五 |
液体 40 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
NAD 标准品 |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
NADH 标准品 |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
溶液的配制:1、 NAD 标准品:临用前加入 1.5 mL 蒸馏水,即 2 µmol/mL。-20℃可以保存 2 周。
2、 NADH 标准品:临用前加入 1.4 mL 蒸馏水,即 2 µmol/mL。-20℃可以保存 2 周。
产品说明:
辅酶 I 包括还原型和氧化型两种形式,在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶 I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是脱氢酶的辅酶,它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给 NAD,使之成为 NADH(还原型辅酶 I)。而 NADH 则会作为氢的载体,在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式,合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义,与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶 I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。
分别用酸性和碱性提取液提取样本中 NAD+和 NADH,在 1-mPMS 作用下,WST-1 可与 NADH 反应,产生水溶性 formazan,在 450nm 下有特征吸收峰,而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一步采用 WST-1 检测。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:可见分光光度计、低温离心机、水浴锅,研钵/匀浆器、超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
1、血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:建议取 0.1mL 血清(血浆),加入 0.5mL 酸性提取液,煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失); 冰浴冷却后,10000g, 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 碱性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。
NADH 的提取:建议取 0.1mL 血清(血浆),加入 0.5 mL 碱性提取液,煮沸 5min (盖紧,以防止水分散失);冰浴冷却后,10000g, 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 酸性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。
2、组织中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:建议取 0.1g 组织质量,加入 0.5mL 酸性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min (盖紧,以防止水分散失);冰浴冷却后,10000g, 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 碱性提取液使之中和;混匀, 10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。
NADH 的提取:建议取 0.1 g 组织质量,加入 0.5 mL 碱性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min (盖紧,以防止水分散失);冰浴冷却后,10000g, 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 酸性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。
3、细胞或细菌中 NAD+ 和 NADH 的提取:
NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,离心弃上清,建议 500 万细胞或者细菌加入 0.5mL 酸性提取液,超声波破碎(冰浴,功率 200W,超声 3s,停 10s,重复 30 次),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),; 冰浴冷却后,10000g, 4℃离心 10min;取 200μL 上清液,加入 200μL 碱性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。
NADH 的提取:建议 500 万细胞或者细菌加入 0.5mL 碱性提取液,超声波破碎(冰浴,功率 200W,超声 3s,停 10s,重复 30 次),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),;冰浴冷却后,10000g, 4℃离心 10min; 取 200μL 上清液,加入 200μL 酸性提取液使之中和;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 450 nm,蒸馏水调零。
2、 NAD 标准品:用蒸馏水稀释为 0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.019、0nmol/mL 的标准溶液。0nmol/mL 即为空白管(A 空)。
3、 NADH 标准品:用蒸馏水稀释为 0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.019、0nmol/mL 的标准溶液。0nmol/mL即为空白管(A 空)。
三、NAD+和 NADH 含量计算
1、标准曲线绘制:
(1) NAD标准曲线的绘制:根据标准管的浓度(x1,nmol/mL)和吸光度ΔA标准(y1,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA 测定代入方程得到x1(nmol/mL)。
(2) NADH标准曲线的绘制根据标准管的浓度(x2,nmol/mL)和吸光度ΔA标准(y2,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA´ 代入方程得到x2(nmol/mL)。
2、NAD+和NADH含量计算
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