上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测,Elisa代测,HPLC 检测,GC检测,GC-MS 检测,LC-MS检测,ICP-MS检测 、土壤、植物、动物,成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号:UPLC-MS-4302 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4301 | 规格:50T/24S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 120 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂一 |
粉剂×2 支 |
2-8℃保存 |
标准品 |
粉剂×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前取 1 支加入 1 mL 无水乙醇混匀溶解,用不完的试剂可以 2-8℃保存一周;(1 支粉剂溶解后可做 100T,为了延长使用时间,此产品多给 1 支粉剂)
2、 标准品:5 mg 没食子酸丙酯。临用前加入 1.178 mL 无水乙醇充分混匀溶解,配成 20 μmol/mL 的标准溶液,2-8℃保存两周。
单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase,EC 3.1.1.20),存在于富含单宁的植物,也广泛存在于微生物中,可以水解酯键和缩酚羧键,生成没食子酸和葡萄糖。
使用没食子酸丙酯(PG)作为单宁酶酶促反应的底物,其在270nn下有特征吸收峰,根据其反应前后吸光度的变化来计算单宁酶活力。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
1、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆。10000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。10000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min,波长调至270nm,紫外分光光度计蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释:取5μL 20μmol/mL的标准溶液,加入1995μL提取液,充分混匀,配制成0.05μmol/mL标准液使用,现用现配。(实验中每管需要200μL,为减小实验误差,故配制大体积。)
3、 对照管样本处理:吸取0.02mL样本于1.5mLEP管中作为对照管,沸水浴5min,冷却至常温待测。
4、 加样表(在1.5mLEP管中分别加入)
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
提取液 |
170 |
170 |
试剂一 |
10 |
10 |
样本 |
20 |
20(已灭活) |
混匀,置于40℃水浴锅中准确反应10min,立即沸水浴5min,冰浴冷却至常温。10000rpm,室温离心10min,取上清待测。 |
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上清液 |
10 |
10 |
提取液 |
190 |
190 |
充分混匀后测定 270nm 处的吸光度,分别记为 A 测定、A 对照,计算ΔA 测定=A 对照-A 测定。另 取 200μL 标准液于微量石英比色皿/96 孔 UV 板中,测定 270nm 处的吸光度,记为 A 标准。每个测定管需设一个对照管。标准管只需测 1-2 次。 |
1、按蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶(U/mg prot)=ΔA测定÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×Cpr)÷T
=1000×ΔA测定÷A标准÷Cpr
2、按样本质量计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶(U/g 质量)=ΔA测定÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×W÷V提取)÷T
=1000×ΔA测定÷A标准÷W
3、按细胞或细菌数量计算:
单位的定义:每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶(U/104 cell)=ΔA测定÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×500÷V提取)÷T
=2×ΔA测定÷A标准
C标准:标准溶液的浓度,0.05μmol/mL;F:上清液的稀释倍数,上述反应体系中 F=200μL÷10μL=20;1000: 单位换算系数,1μmol=1000nmol;V样本:加入的样本体积,0.02mL;V酶促:酶促反应总体积,0.2mL;Cpr: 样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V提取:提取液体积,1mL;500:500万个细胞;T:反应时间,10min。
如果A测定大于1.5,可以适当加大稀释倍数,保证总体积0.2mL不变,如5μL上清液和195μL提取液(相当于F=200/5=40),计算公式中需改变F和V上清液的数值。
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