单宁酶活性检测试剂盒-单宁酶试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4302 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4301 规格:50T/24S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 120 mL×1

2-8℃保存

试剂一

粉剂×2

2-8℃保存

标准品

粉剂×1

2-8℃保存

溶液的配制:

1、 试剂一:临用前取 1 支加入 1 mL 无水乙醇混匀溶解,用不完的试剂可以 2-8℃保存一周;(1 支粉剂溶解后可做 100T,为了延长使用时间,此产品多给 1 支粉剂)

2 标准品:5 mg 没食子酸丙酯。临用前加入 1.178 mL 无水乙醇充分混匀溶解,配成 20 μmol/mL 的标准溶液,2-8℃保存两周。

产品说明:

单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase,EC 3.1.1.20),存在于富含单宁的植物,也广泛存在于微生物中,可以水解酯键和缩酚羧键,生成没食子酸和葡萄糖。

使用没食子酸丙酯(PG)作为单宁酶酶促反应的底物,其在270nn下有特征吸收峰,根据其反应前后吸光度的变化来计算单宁酶活力。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆。10000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。10000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1 紫外分光光度计/酶标仪预热30min,波长调至270nm,紫外分光光度计蒸馏水调零。

2 标准液的稀释:取5μL 20μmol/mL的标准溶液,加入1995μL提取液,充分混匀,配制成0.05μmol/mL标准液使用,现用现配。(实验中每管需要200μL,为减小实验误差,故配制大体积。)

3 对照管样本处理:吸取0.02mL样本于1.5mLEP管中作为对照管,沸水浴5min,冷却至常温待测。

4 加样表(在1.5mLEP管中分别加入)

试剂名称(μL

测定管

对照管

提取液

170

170

试剂一

10

10

样本

20

20(已灭活)

混匀,置于40℃水浴锅中准确反应10min,立即沸水浴5min,冰浴冷却至常温。10000rpm,室温离心10min,取上清待测。

上清液

10

10

提取液

190

190

充分混匀后测定 270nm 处的吸光度,分别记为 A 测定、A 对照,计算ΔA 测定=A 对照-A 测定。另

200μL 标准液于微量石英比色皿/96 UV 板中,测定 270nm 处的吸光度,记为 A 标准。每个测定管需设一个对照管。标准管只需测 1-2 次。

三、单宁酶活力计算

1、按蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶(U/mg prot)=ΔA测定÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×Cpr)÷T

=1000×ΔA测定÷A标准÷Cpr

2、按样本质量计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶(U/g 质量)=ΔA测定÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×W÷V提取)÷T

=1000×ΔA测定÷A标准÷W

3、按细胞或细菌数量计算:

单位的定义:每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶(U/104 cell)=ΔA测定÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×500÷V提取)÷T

=2×ΔA测定÷A标准

C标准:标准溶液的浓度,0.05μmol/mL;F:上清液的稀释倍数,上述反应体系中 F=200μL÷10μL=20;1000 单位换算系数,1μmol=1000nmol;V样本:加入的样本体积,0.02mL;V酶促:酶促反应总体积,0.2mL;Cpr 样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V提取:提取液体积,1mL;500:500万个细胞;T:反应时间,10min。

注意事项:

如果A测定大于1.5,可以适当加大稀释倍数,保证总体积0.2mL不变,如5μL上清液和195μL提取液(相当于F=200/5=40),计算公式中需改变F和V上清液的数值。


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