上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4387	规格：100T/96S	微量法
货号：UPLC-MS-4386	规格：50T/48S	紫外分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、试剂二：临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存；

2、试剂三：临用前加入 3.33 mL 蒸馏水充分溶解待用，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融；

3、试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加 2 mL 试剂一充分溶解，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

产品说明：

MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪和双蒸水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2、细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；然后 10000rpm，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一在25℃水浴锅中预热30min。

3、 依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂

迅速混匀后于 340nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值，分别记为 A1、A2，ΔA=A1-A2，得到 ΔA 测定管、ΔA 空白管。

三、MDHAR 活性计算

          a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

           1. 按蛋白浓度计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。MDHAR (U/mg prot) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr

2. 按样本质量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。MDHAR (U/g  质量) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W

3. 按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。MDHAR (U/104 cell) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷细胞数量

ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，60μL=0.06mL；V样总：提取液体积， 1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；W：样本质量，g；T：反应时间，2min；细胞数量：以104为单位计量，万个。

b. 使用96孔UV板测定的计算公式如下：

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。 

注意事项：

1. 当 ΔA 测定大于 0.3 时（96 孔板 ΔA 测定大于 0.2），建议客户稀释样本或者调整试剂一和上清液的比例（如将 400μL 试剂一+300μL 上清液改为 600μL 试剂一+100μL 上清液）后进行测定。

2. 当 ΔA 测定过小时，建议客户提高样本量或者调整试剂一和上清液的比例（如将 400μL 试剂一+300μL 上清液改为 200μL 试剂一+500μL 上清液）。

3. 当 A1 大于 1.5 时（酶标仪测定时 A1 大于 2 时），建议将样本稀释进行测定。

4. 空白管为检测各管试剂组份的检测孔，正常情况下，其 OD 值在 0.5 左右（96 孔板在 0.3 左右），变化不超过 0.01。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。