上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4192	规格：100T/96S	微量法
货号：UPLC-MS-4191	规格：50T/48S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂三：临用前加入 3 mL 蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

2、 试剂四：临用前加入 2 mL 蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3、 试剂六：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前按试剂六：试剂六稀释液=1:428（V:V）的比例稀释试剂六备用，现用现配；

4、 工作液的配制：按照试剂二：试剂三：试剂四=2:1:1 的体积比例充分混匀，现用现配。

产品说明：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的第一个限速酶。

PC 不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO₂ 和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH 生成苹果酸和 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 氧化速率，即可反映 PC 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤;

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 4℃1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4℃11000g 离心 15min。

3、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PC（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4、 在沉淀中加入 1mL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 12 次），用于 PC 活性测定， 并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一用前37℃孵育15min。

3、 操作表：

三、PC酶活计算

         1. 按微量石英比色皿计算：

单位的定义：每毫克蛋白每分钟消耗1 nmol  的NADH定义为一个酶活力单位。

PC酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 1607×ΔA÷Cpr

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10-4L；V样： 反应体系中样本体积，0.01mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间：2min。

2. 按96孔UV板计算：

将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，ΔA 大于 0.8 时（96 孔 UV 板测定时 ΔA 大于 0.5 时）， 建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当 ΔA 小于 0.01 时，可以延长反应时间（5min 或 10min）来测定。

2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.05。

3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约 1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

5. 本试剂盒试剂足够完成 100 管反应。

6. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为 100T/48S）

         （1） 按微量石英比色皿计算：