溶液的配制：

1、试剂一：临用前取 1 瓶加入 2.67mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融。

2、标准品：5μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。

产品说明：

β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。

β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴， 功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）， 进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2、标准溶液的稀释：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。

3、 标准液稀释可参考下表：

    备注：实验中每个标准管需 500µL 标准溶液。

4、样本测定（在EP 管中依次加入下列试剂）：

充分混匀，于400nm 处测定吸光值A，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A 测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2次。

三、β-GAL活性计算

1、标准曲线的建立：

根据标准管的吸光度（x，ΔA标准）和浓度（y，nmol/mL）建立标准曲线，将ΔA（x，ΔA测定）带入标准曲线中，计算样本生成的产物量y（nmol/mL）。

2、β-GAL活性计算：

             （1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每小时产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GAL活力(U/mg prot)=(y×V 反总)÷(V 样×Cpr)÷T=20×y÷Cpr

（2） 按样本质量计算：

单位的定义：每g 组织每小时产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GAL活力(U/g 质量)＝(y×V 反总)÷(W×V 样÷V 样总)÷T=20×y÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。