| 货号：UPLC-MS-4217 | 规格：100T/48S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4216 | 规格：50T/24S | 可见分光光度法 |
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体100 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂一 |
粉剂×2 支 |
2-8℃保存 |
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试剂二 |
液体30 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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标准品 |
粉剂×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 试剂一：临用前取 1 支加 1 mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；
2. 标准品：10 mg 无水葡萄糖，临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解，配制成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用，2-8℃保存 2 周。
产品说明：
β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此 β-1,3-GA 活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
β-1,3-GA 水解昆布多糖，内切 β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率，来计算其酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200w，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
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序号 |
稀释前浓度（mg/mL） |
标准液体积（µL） |
蒸馏水体积（µL） |
稀释后浓度（mg/mL） |
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1 |
10 |
100 |
900 |
1 |
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2 |
1 |
160 |
40 |
0.8 |
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3 |
1 |
120 |
80 |
0.6 |
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4 |
1 |
80 |
120 |
0.4 |
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5 |
1 |
40 |
160 |
0.2 |
实验中每个标准管需 35µL 标准溶液。
4. 样本测定，（在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂）
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试剂名称（μL） |
测定管 |
对照管 |
标准管 |
空白管 |
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样本 |
35 |
35 |
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标准液 |
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35 |
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蒸馏水 |
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35 |
35 |
70 |
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试剂一 |
35 |
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充分混匀，放入 37℃水浴 60 min |
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试剂二 |
230 |
230 |
230 |
230 |
充分混匀，沸水浴 5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，取 200μL 至微量玻璃比色皿或 96 孔板中，540nm 处记录各管吸光值A，ΔA=A 测定-A 对照。空白管和标准曲线只需做 1-2 次。如果吸光值大于 2，可以用提取液对样本稀释后测定。三、β-1,3-GA 活性计算
1、标准曲线的建立：
根据标准管吸光度x（A 标准管-A 空白管）和浓度（y，mg/mL）建立标准曲线，将 ΔA 带入公式中计算出样本中产生的还原糖的含量y 值（mg/mL）。
2、β-1,3-GA 活性计算：
(1) 按蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(U/mg prot)=(y×V1)÷(V1×Cpr)÷T=y÷Cpr
(2) 按样本质量计算
单位的定义：每g 组织每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(U/g 质量)=(y×V1)÷(W×V1÷V2)÷T=y÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每 1 万个细胞或细菌每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(U/104 cell)=(y×V1)÷(500×V1÷V2)÷T=0.002×y
V1：加入反应体系中样本体积，0.035mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；T：反应时间，60min=1h；500：细菌或细胞总数，500 万。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到
