上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂八：临用前加入 0.8 mL 双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃避光保存。

2. 工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。

产品说明：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一， 催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称取约 0.1g 组织或收集约 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二，冰浴用匀浆器或研钵充分研磨，4 ℃ 11000g 离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、操作步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 空白管：取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL试剂八和12μL 蒸馏水，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A2，计算ΔA 空白=A2-A1。

3、 测定管：取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL试剂八和12μL样本，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。

三、α-KGDH活性计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(Cpr×V样) ÷T=1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性（U/g 质量）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3. 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性（U/104 cell）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×500)÷T

=2.977×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，2.2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.012mL；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

b. 用96孔板测定的计算公式如下：

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(Cpr×V样) ÷T=2456.2×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性（U/g 质量）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=2480.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3. 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性（U/104 cell）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=4.962×(ΔA测定-ΔA空白)