货号:UPLC-MS-6041 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-6040 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 60 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂一 |
液体 50 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂三 |
液体 20 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂四 |
3mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
标准品 |
液体 1mL×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前每支加入 1mL 试剂四溶解,溶解后的试剂在-20℃分装保存,可以保存 4 周。
2、 标准品:5mmol/L 的对硝基苯酚标准液。
α-man 分布广泛、种类繁多,在真核生物胞质、内质网、高尔基体、溶酶体中都有发现,不同种类、功能的 α-man共同参与N-聚糖的修饰过程。
α-man 和特定底物发生反应,其生成物在 405nm 处有特征吸收峰,根据吸光度的变化率可计算出 α-man 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、匀浆器/研钵、冰和蒸馏水。
1、组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 12000 g,4℃,离心 10 min,取上清置于冰上待测。
2、细胞或细菌:先收集细胞或细菌到离心管内,离心后弃上清;按照细胞或细菌数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000︰1 的比例(建议 500 万个细胞或细菌加入 1 mL 提取液)进行提取,冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率 200 W,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);然后 12000 g,4℃,离心 10 min,取上清置于冰上待测。
3、液体:直接检测。若有浑浊可以离心后测定
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 405 nm,蒸馏水调零。
2、 将 5mmol/L 的对硝基苯酚标准液用蒸馏水稀释为 0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0.005mmol/L的标准溶液备用。
3、 操作表:(在 1.5 mL 离心管中)
试剂名称(µL ) |
测定管 |
对照管 |
标准管 |
空白管 |
样本 |
125 |
125 |
- |
- |
标准溶液 |
- |
- |
125 |
- |
试剂一 |
550 |
625 |
625 |
625 |
试剂二 |
75 |
- |
- |
- |
蒸馏水 |
- |
- |
- |
125 |
混匀,37℃水浴或恒温培养箱中准确反应 10 min |
||||
试剂三 |
250 |
250 |
250 |
250 |
混匀,测定 405 nm 处吸光值 A,分别记为A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算 ΔA=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。每个测定管需设一个对照管,标准曲线、空白管只需检测 1-2 次。 |
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(mmol/L,即 μmol/mL)。
2、 α-甘露糖苷酶活性的计算:
(1) 按蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 蛋白每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。
α-甘露糖苷酶酶活(U/mg prot)= x× V 样÷(V 样×Cpr )÷T× F= x×0.1÷ Cpr ×F
(2) 按样本质量计算
酶活定义:每g 样本每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。
α-甘露糖苷酶酶活(U/g 质量)= x× V 样÷(W×V 样÷V 提取)÷T× F= x×0.1÷W×F
(3) 按照细胞或细菌数量计算
酶活定义:每 104 个细胞每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。
α-甘露糖苷酶酶活(U/104 cell)= x× V 样÷(细胞数量×V 样÷V 提取)÷细胞数量(万个)÷T× F= x×0.1÷ 细胞数量(万个)×F
(4) 按液体体积计算
酶活定义:每 mL 样本每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。
α-甘露糖苷酶酶活(U/mL)=x×V 样÷V 样÷T× F= x×0. 1×F
V 提取:提取液体积,1 mL;V 样:加入的样本体积,0.125 mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,10 min; F:稀释倍数。
1、如果测定吸光值A>1.5 或 ΔA>1,建议稀释样本后再测定,计算公式中乘以稀释倍数;如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值,建议增加样本量后再进行测定。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到