α-甘露糖苷酶(α-man)活性检测试剂盒-α-甘露糖苷酶(α-man)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-6041 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-6040 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品内容使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致有疑问请及时联系工作人员

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 60 mL×1

2-8℃保存

试剂一

液体 50 mL×1

2-8℃保存

试剂二

粉剂×2

-20℃保存

试剂三

液体 20 mL×1

2-8℃保存

试剂四

3mL×1

2-8℃保存

标准品

液体 1mL×1

2-8℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前每支加入 1mL 试剂四溶解,溶解后的试剂在-20℃分装保存,可以保存 4 周。

2 标准品:5mmol/L 的对硝基苯酚标准液。

产品说明

α-man 分布广泛、种类繁多,在真核生物胞质、内质网、高尔基体、溶酶体中都有发现,不同种类、功能的 α-man共同参与N-聚糖的修饰过程。

α-man 和特定底物发生反应,其生成物在 405nm 处有特征吸收峰,根据吸光度的变化率可计算出 α-man 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、匀浆器/研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤

        一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL) 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 12000 g,4℃,离心 10 min,取上清置于冰上待测。

2、细胞或细菌:先收集细胞或细菌到离心管内,离心后弃上清;按照细胞或细菌数量(104 个):提取液体积(mL) 500~1000︰1 的比例(建议 500 万个细胞或细菌加入 1 mL 提取液)进行提取,冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率 200 W,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);然后 12000 g,4℃,离心 10 min,取上清置于冰上待测。

3、液体:直接检测。若有浑浊可以离心后测定

二、测定步骤

1 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 405 nm,蒸馏水调零。

2 5mmol/L 的对硝基苯酚标准液用蒸馏水稀释为 0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0.005mmol/L的标准溶液备用。

3 操作表:( 1.5 mL 离心管中)

试剂名称(µL

测定管

对照管

标准管

空白管

样本

125

125

-

-

标准溶液

-

-

125

-

试剂一

550

625

625

625

试剂二

75

-

-

-

蒸馏水

-

-

-

125

混匀,37℃水浴或恒温培养箱中准确反应 10 min

试剂三

250

250

250

250

混匀,测定 405 nm 处吸光值 A,分别记为A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计 ΔA=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。每个测定管需设一个对照管,标准曲线、空白管只需检测 1-2 次。

三、α-甘露糖苷酶(α-man)活性计算

1 标准曲线的绘制:

以各个标准溶液的浓度为x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(mmol/L,即 μmol/mL)。

2 α-甘露糖苷酶活性的计算:

(1) 按蛋白浓度计算

酶活定义:每 mg 蛋白每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活(U/mg prot)= x× V 样÷(V 样×Cpr )÷T× F= x×0.1÷ Cpr ×F

(2) 按样本质量计算

酶活定义:每g 样本每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活(U/g 质量)= x× V 样÷(W×V 样÷V 提取)÷T× F= x×0.1÷W×F

(3) 按照细胞或细菌数量计算

酶活定义:每 104 个细胞每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活(U/104 cell)= x× V 样÷(细胞数量×V 样÷V 提取)÷细胞数量(万个)÷T× F= x×0.1÷ 细胞数量(万个)×F

(4) 按液体体积计算

酶活定义:每 mL 样本每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活(U/mL)=x×V 样÷V 样÷T× F= x×0. 1×F

V 提取:提取液体积,1 mL;V 样:加入的样本体积,0.125 mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,10 min F:稀释倍数。

注意事项

1、如果测定吸光值A>1.5 ΔA>1,建议稀释样本后再测定,计算公式中乘以稀释倍数;如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值,建议增加样本量后再进行测定。


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