| 货号：UPLC-MS-4170 | 规格：100T/48S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4169 | 规格：50T/24S | 可见分光光度法 |
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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试剂一 |
液体 40 mL×1 瓶 |
常温保存 |
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试剂二 |
液体 10 mL×2 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂三 |
粉剂×2 支 |
2-8℃保存 |
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标准品 |
粉剂×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂一：若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用；
2、 试剂二：临用前取 1 支试剂三加入到 1 瓶试剂二中，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；
3、 标准品：10 mg 无水葡萄糖。临用前加 1 mL 蒸馏水，配成 10 mg/mL 葡萄糖标准液，2-8℃保存两周。
产品说明：淀粉酶负责水解淀粉，包括 α-淀粉酶和 β-淀粉酶。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可随机地作用于淀粉中的 α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。
淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在 540nm 有吸收峰；
通过测定 540nm 吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。α-AL 耐热，但是 β-淀粉酶可在 70℃钝化 15min。因此粗酶液经过 70℃钝化 15min，就只有 α-AL 能够催化淀粉水解。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。
称取约 0.1g 样本，加 0.8mL 蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取 15min，每隔 5min 振荡 1 次，使其充分提取；6000g，常温离心 10min，吸取上清液并加蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 mg/mL 的标准溶液。
3、 标准液稀释可参考下表：
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序号 |
稀释前浓度（mg/mL） |
标准液体积（µL） |
蒸馏水体积（µL） |
稀释后浓度（mg/mL） |
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1 |
10 |
20 |
980 |
0.2 |
|
2 |
0.2 |
500 |
500 |
0.1 |
|
3 |
0.1 |
500 |
500 |
0.05 |
|
4 |
0.05 |
500 |
500 |
0.025 |
|
5 |
0.025 |
500 |
500 |
0.0125 |
|
6 |
0.0125 |
500 |
500 |
0.00625 |
备注：实验中每个标准管需 250µL 标准溶液。
4、 对照管样本处理：取 250μL 样本沸水浴 5min 作为对照管使用。
5、 按操作表依次加入各试剂：
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试剂（μL） |
对照管 |
测定管 |
标准管 |
空白管 |
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α-淀粉酶原液 |
250（煮沸样本） |
250 |
- |
- |
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蒸馏水 |
- |
- |
- |
250 |
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标准溶液 |
- |
- |
250 |
- |
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置于 70℃水浴锅中准确反应 15min，冷却至室温 |
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试剂二 |
- |
250 |
- |
- |
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置于 40℃水浴锅中准确保温 5min |
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试剂一 |
500 |
500 |
500 |
500 |
|
试剂二 |
250 |
- |
250 |
250 |
混匀，沸水浴 10min，540nm 处读取吸光度，分别记为A 对照、A 测定、A 标准和A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测 1-2 次。
1、 标准曲线的绘制：
以标准液的浓度（mg/mL）为 x 轴，对应的 ΔA 标准为 y 轴绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将 ΔA 测定带入方程中计算得到样本浓度（x，mg/mL）。
2、α-淀粉酶活性的计算：
（1） 按照样本质量计算
单位定义：每g 组织每分钟催化产生1 mg 还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(U/g 质量)=x×V 样÷(W×V 样÷V 样总)÷T=2×x÷W
（2） 按照蛋白质浓度计算
单位定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生1 mg 还原糖定义为1 个酶活性单位。
α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x×V 样÷（V样×Cpr ）÷T=0.2×x÷Cpr
V样：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V样总：提取液总体积，10mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；T：反应时间，5min。
注意事项：
吸光值大于1时，可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小，可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。注意同步修改计算公式。
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