货号:UPLC-MS-4373 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4372 | 规格:50T/48S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 30 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 支 |
4℃保存 |
试剂三 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂四 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂五 |
液体 20 mL×1 瓶 |
常温保存 |
标准品 |
液体 1 mL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:用时加入 1.5 mL 试剂一充分溶解备用,现配现用。
2、 试剂三:用时加入 20 mL 双蒸水,溶解后 4℃可保存一周。
3、 试剂四:用时加入 20 mL 双蒸水,溶解后 4℃可保存一周。
4、 标准品:10 mmol/L 标准磷贮备液。将标准品 20 倍稀释,即取 0.5 mL 标准液加 9.5 mL 蒸馏水,充分混匀,配制成 0.5 μmol/mL 标准磷应用液。
5、 定磷试剂的配制:按 H2O:试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色, 若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷试剂根据实验用量现用现配。
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
NADPase主要存在于植物组织中,是生物体内唯一催化NADP+降解为NAD+的酶,与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
NADPase能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应,通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿、匀浆器/研钵和蒸馏水。
组织样本:称取约0.1g样本,加提取液1.0 mL充分研磨,于4℃,8000g离心10min,取上清液置冰上待测。
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。
2、 操作表:酶促反应
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
300 |
300 |
试剂二 |
100 |
|
蒸馏水 |
|
100 |
37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5min |
||
样本 |
100 |
100 |
37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应20min后,沸水浴5min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,10000g常温离心10min,取上清。
3、 定磷:
试剂名称(μL) |
标准管 |
空白管 |
测定管 |
对照管 |
0.5μmol/mL标准磷应用液 |
100 |
|
|
|
蒸馏水 |
|
100 |
|
|
上清液 |
|
|
100 |
100 |
定磷试剂 |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
混匀,37℃水浴30min,冷却至室温,在660nm处,蒸馏水调零,记录各管吸光值,记为A标准管、A空白管、A 测定管、A对照管,并计算ΔA标准=A标准管-A空白管,ΔA测定=A测定管-A对照管。(空白管和标准管只要做1-2 次)
1、 按组织蛋白浓度计算:
定义:规定每分钟每毫克组织蛋白中NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个NADPase活力单位。
NADPase (U/mg prot) =ΔA测定÷ΔA标准÷C标准×V上清÷(Cpr×V样本×V上清÷V酶促)÷T
=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
2、 按样本质量计算:
定义:规定每分钟每克组织中NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个NADPase活力单位。
NADPase (U/g 质量)=ΔA测定÷ΔA标准÷C标准×V上清÷(W×V样本÷V提取×V上清÷V酶促)÷T
=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W
C标准:0.5μmol/mL的磷标准应用液;V上清:定磷试验中上清液体积,0.1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V 样本:酶促反应中样本体积,0.1mL;V酶促:酶促反应总体积,0.5mL;T:反应时间,20min;V提取:提取液体积,1mL;W:样本质量,g。
1、 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格,要没有一点磷,若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液,一定要洗得非常干净,要先用洗洁精加水煮,再用自来水冲,最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管,避免磷污染是检测成败的关键。
2、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到