货号:UPLC-MS-4213 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4212 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂三 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
液体 1 mL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 2 mL 蒸馏水溶解备用;可-20℃分装保存,避免反复冻融,-20℃可保存 2 周;
2、 标准品:5 μmol/mL 对硝基苯酚溶液。临用前用蒸馏水将标准品稀释 8 倍得 0.625 μmol/mL 的标准溶液。
N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.52,N-acetyl-β-D-glucosidase,NAG)广泛分布于各种组织中,是一种细胞内溶体酶,测定NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。
NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定400nm下吸光度的变化来计算NAG活性。
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取 0.1g 组织,加入 1mL 提取液) 进行冰浴匀浆。15000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
2、细菌、细胞:按照细胞数量 104 个:提取液体积(ml)500~1000:1 的比例,建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(率 300w,超声 3 s,间隔 7s,总时间 3min)然后 15000g,4℃,离心 10min,取上清置冰上待测。
3、血清(浆)等液体:直接测定。
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、 操作表 (在1.5mL离心管中依次加入下列试剂) :
试剂名称(µL) |
测定管 |
对照管 |
标准管 |
空白管 |
试剂一 |
60 |
60 |
60 |
60 |
试剂二 |
30 |
- |
- |
- |
37℃下预热5min |
- |
- |
||
蒸馏水 |
- |
30 |
30 |
40 |
标准液 |
- |
- |
10 |
- |
样本 |
10 |
10 |
- |
- |
37℃反应30min |
|
|
||
试剂三 |
200 |
200 |
200 |
200 |
混匀后室温放置 2min,吸取 200μL 于微量玻璃比色皿或者 96 孔板中测定 400nm 的吸光度,分别记为 A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。
1、按蛋白浓度计算
活力单位定义:每mg蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG (U/mg prot) =ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(Cpr×V样)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr 2、按样本质量计算
活力单位定义:每g样本在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG (U/g 质量)= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(V样÷V样总×W)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W
3、按细胞数量计算
活力单位定义:每104个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG (U/104 cell)= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷细胞数量
4、按液体体积计算
活力单位定义:每毫升液体在反应体系中每分钟催化生成1nmol对硝基苯酚为一个酶活力单位。
NAG (U/mL)= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷V样÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准
C标:标准溶液的浓度:0.625μmol/mL;V样总:提取液体积,1mL;V样:加入的样本体积,0.01mL;Cpr: 上清液蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,30min;细胞数量:以万计;W:样本质量,g;1000:换算系数, 1μmol=1000nmol。
吸光度若大于2时,建议将样本用提取液稀释后进行测定。
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