N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶(NAG)活性检测试剂盒-N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4213 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4212 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 60 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 10 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

-20℃保存

试剂三

液体 20 mL×1

4℃保存

标准品

液体 1 mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前加入 2 mL 蒸馏水溶解备用;可-20℃分装保存,避免反复冻融,-20℃可保存 2 周;

2 标准品:5 μmol/mL 对硝基苯酚溶液。临用前用蒸馏水将标准品稀释 8 倍得 0.625 μmol/mL 的标准溶液。

产品说明:

N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.52,N-acetyl-β-D-glucosidase,NAG)广泛分布于各种组织中,是一种细胞内溶体酶,测定NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。

NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定400nm下吸光度的变化来计算NAG活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者

增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取 0.1g 组织,加入 1mL 提取液 进行冰浴匀浆。15000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2、细菌、细胞:按照细胞数量 104 个:提取液体积(ml)500~1000:1  的比例,建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞( 300w,超声 3 s,间隔 7s,总时间 3min)然后 15000g,4℃,离心 10min,取上清置冰上待测。

3、血清(浆)等液体:直接测定。

二、测定步骤

1 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。

2 操作表 (在1.5mL离心管中依次加入下列试剂) :


试剂名称(µL

测定管

对照管

标准管

空白管

试剂一

60

60

60

60

试剂二

30

-

-

-

37℃下预热5min

-

-

蒸馏水

-

30

30

40

标准液

-

-

10

-

样本

10

10

-

-

37℃反应30min

 

 

试剂三

200

200

200

200

混匀后室温放置 2min,吸取 200μL 于微量玻璃比色皿或者 96 孔板中测定 400nm 的吸光度,分别记为 A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。

三、NAG活性计算

1、按蛋白浓度计算

活力单位定义:每mg蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

NAG (U/mg prot) =ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(Cpr×V样)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr 2、按样本质量计算

活力单位定义:每g样本在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

NAG (U/g 质量)= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(V样÷V样总×W)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3、按细胞数量计算

活力单位定义:每104个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

NAG (U/104 cell)= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷细胞数量

4、按液体体积计算

活力单位定义:每毫升液体在反应体系中每分钟催化生成1nmol对硝基苯酚为一个酶活力单位。

NAG (U/mL)= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷V样÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准

C标:标准溶液的浓度:0.625μmol/mL;V样总:提取液体积,1mL;V样:加入的样本体积,0.01mL;Cpr 上清液蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,30min;细胞数量:以万计;W:样本质量,g;1000:换算系数, 1μmol=1000nmol。

注意事项:

吸光度若大于2时,建议将样本用提取液稀释后进行测定。


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