| 货号：UPLC-MS-4573 | 规格：100T/48S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4572 | 规格：50T/24S | 可见分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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试剂一 |
液体 30 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂二 |
液体 4 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂三 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
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试剂四 |
液体 2 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂五 |
液体 3mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂六 |
粉剂×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂七 |
粉剂×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂八 |
液体 15 mL×1 瓶 |
常温保存 |
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标准品 |
液体 1 mL×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂三：用时取 1 支加 1 mL 蒸馏水，现用现配。用不完的试剂-20℃分装保存一周。
2、 试剂六：用时加入 15 mL 蒸馏水，溶解后 2-8℃保存两周。
3、 试剂七：用时加入 15 mL 蒸馏水，溶解后 2-8℃保存两周。
4、 标准品：10 μmol/mL 标准磷贮备液。将标准品 20 倍稀释，即取 0.1 mL 标准品加 1.9 mL 蒸馏水充分混匀， 配成 0.5 μmol/mL 标准磷应用液。
5、 定磷剂的配制：按 H2O：试剂六：试剂七：试剂八=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若变色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂根据实验用量现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
Na+K+- ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。Na+K+-ATP 酶分解 ATP 生成 ADP 及无机磷，通过测定无机磷的量来确定 ATP 酶活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌、细胞或组织样本的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200w，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样本：直接检测。
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）
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试剂名称 |
对照管 |
测定管 |
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试剂一（μL） |
130 |
90 |
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试剂二（μL） |
80 |
80 |
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试剂三（μL） |
40 |
40 |
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试剂四（μL） |
- |
40 |
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样本（μL） |
- |
200 |
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混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min |
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试剂五（μL） |
50 |
50 |
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样本（μL） |
200 |
- |
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混匀，4000g，常温离心 10min，取上清液 |
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3、定磷(在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂)
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试剂名称 |
空白管 |
标准管 |
对照管 |
测定管 |
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0.5μmol/mL 标准磷应用液（μL） |
- |
100 |
- |
- |
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上清液（μL） |
- |
- |
100 |
100 |
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蒸馏水（μL） |
100 |
- |
- |
- |
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定磷试剂（μL） |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
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混匀，40℃水浴 10 min，冷却至室温，在 660nm 处比色。分别记为 A 空白、A 标准、A 对照、A 测定。每个测定管需设一个对照管，标准管和空白管只需测 1-2 次。 |
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1、血清（浆）Na+K+-ATPase 活力的计算：
定义：规定每小时每毫升血清（浆）中 Na+K+- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmoL 无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP 酶活力（U/mL）= C 标×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）×V 总÷V 样÷T=7.5×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）
2、组织、细菌或细胞中 Na+K+- ATPase 活力的计算：
（1） 按蛋白浓度计算：
定义：规定每小时每毫克组织蛋白中 Na+K+- ATP 酶分解 ATP 产生
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到
