于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 0s 吸光值记为 A1，第 180s 吸光值记为 A2。记 ΔA 测定=A2 测定-A1

测定，ΔA 空白=A2 空白-A1 空白。

三、6PGDH 活性计算

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） 按蛋白浓度计算活性单位定义：

每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/mg prot) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样)÷T=536×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr

（2） 按样本质量计算活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/g 质量) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=536×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.0002L；Cpr： 粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；V 样：反应体系中加入粗酶液体积，0.02mL；V 样总：提取液体积，1mL； T：反应时间，3min；W：样本质量，g。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

（1） 按蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/mg prot)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样)÷T=893×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr

（2） 按样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/g 质量) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=893×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：96 孔板光径，0.6cm；V 反总：反应体系总体积，0.0002L；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；V 样：反应体系中加入粗酶液体积，0.02mL；V 样总：提取液体积，1mL； T：反应时间，3min；W：样本质量，g。

注意事项：

1. 试剂二和试剂三须现配现用，当天未用完试剂保存在 4℃，可保存 1 周。

2. 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在提取当日完成酶活性测定，粗酶液避免反复冻融；

3. 若样本初始（0s）读值大于 0.5 且 ΔA 测定小于 0.1，可尝试将样本进行稀释后测定。使用96孔板测定时，可根据样本数量将试剂一（预热后）、二、三预混为工作液，因是根据反应速率计算酶活， 为保证每个样本的反应时间尽量一致不推荐同时测过多样本。