上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-6039	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-6038	规格：50T/24S	可见分光光度法

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂五：临用前加入 12 mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂 4℃保存两周。

2、 试剂六：临用前加入 12 mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂 4℃保存两周。

3、 工作液配制：临用前取 1 支试剂一中加入到 1 瓶试剂二中充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存一周， 现用现配。

4、 定磷试剂的配制：按 H₂O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

5、 标准品：8 mg 磷标准品。临用前加入 4.6 mL 试剂四溶解配制成 10 μmol/mL 的标准溶液，溶解后 4℃保存两周。

产品说明：

5'-核苷酸酶(5'-NT)是一种对底物特异性不高的水解酶，可作用于多种核苷酸。广泛存在于各种植物、动物组织、血清血浆中。5'-NT 是一种特殊的磷酸酯水解酶，它只作用于核苷-5'-磷酸如 AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成无机磷酸和核苷。通过定磷显色法测定所生成的无机磷含量，可以计算出 5'-NT 的活性高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

天平、可见分光光度计、台式离心机、低温离心机、恒温水浴锅/恒温培养箱、1 mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）﹕提取液体积(mL)为 1﹕5-10  的比例（建议称取约0.1 g，加入1 mL提取液），冰上匀浆后于4℃，15000 g离心10 min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（104个）﹕蒸馏水体积（mL）为500-1000﹕1 的比例（建议500万个细胞加入1 mL提取液）， 冰浴超声波破碎细胞（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min）；然后4℃，15000 g 离心10 min，取上清置于冰上待测。

3. 血清：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 660 nm，蒸馏水调零。

2、 将标准品用试剂四稀释至 0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 μmol/mL 标准液。

3、 操作表（在 1.5 mL EP 管中操作）

（1） 酶促反应

三、5'-NT 活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的 ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y= kx+b，将 ΔA 带入方程得到 x（μmol/mL）。

2、 5'-NT 活性的计算

        （1） 按样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

5'-NT 酶活（U/mg prot）=x×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×103=333.3×x÷Cpr

（2） 按样本质量计算

酶活单位定义：每克组织在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活单位。