3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒-3-磷酸甘油醛脱氢酶检测试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4201 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4200 规格:50T/48S 紫外分光光度法
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 100 mL×1

4℃保存

试剂一

粉剂×1

-20℃保存

试剂二

液体 20 mL×1

4℃保存

试剂三

液体 12 µL×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。根据用量按照试剂三:蒸馏水为 3:100 的体积比例充分混匀,现用现配;

2 工作液的配制:将试剂二全部倒入试剂一瓶中,充分溶解,根据需要取一定的量 37℃(哺乳动物) 25℃(其它物种)预热 10min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

产品说明:

GAPDH(EC1.2.1.12)催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3-二磷酸甘油酸和NADH 生成 3-磷酸甘油醛、无机磷和 NAD+,340nm 处测定 NADH 的减少量可反映 GAPDH 活性的高低。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液 进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心 20min,取上清,置冰上待测。

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴, 功率 20% 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

血清(浆):直接检测。

二、测定步骤:

1 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,分光光度计蒸馏水调零。

2 操作表(在微量石英比色皿或 96 孔板中分别加入下列试剂):

试剂名称

空白管

测定管

样本(µL

 

6

蒸馏水(µL

6

 

试剂三(µL

4

4

工作液(µL

190

190

在微量石英比色皿/96 UV 板中分别加入上述试剂,充分混匀后于340nm 处测定10s 时的吸光值A1 迅速置于 37℃(哺乳动物) 25℃(其他物种)水浴或培养箱 5min(酶标仪有控温功能可将温度调至37℃ 25℃),拿出迅速擦干测定 5min10s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。(空白管只需做 1-2 次)

三、GAPDH 酶活计算:

A、按石英比色皿计算:

(1) 按蛋白浓度计算酶活定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T=1072×ΔA÷Cpr

(2) 按样本质量计算酶活定义:每 g 组织每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)÷T=1072×ΔA÷W

(3) 按照细菌或细胞数量计算酶活定义:每 104 个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.14×ΔA

(4) 按液体体积计算酶活定义:每 mL 样本每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷V 样÷T=1072×ΔA

ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/ mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积,0.0002L;V 样:反应体系中样本体积,0.006mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度需自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间:5min;500:细菌或细胞总数,500 万;109:单位换算系数, 1mol=109nmol。

B、按 96 UV 板计算:

将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1 A1 小于 0.8 ΔA 大于 0.7 时(96 孔板为 A1 小于 0.4 ΔA 大于 0.4),建议将样本稀释后再进行测定。

2 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.02。


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