货号:UPLC-MS-4201 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4200 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂二 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 12 µL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。根据用量按照试剂三:蒸馏水为 3:100 的体积比例充分混匀,现用现配;
2、 工作液的配制:将试剂二全部倒入试剂一瓶中,充分溶解,根据需要取一定的量 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
GAPDH(EC1.2.1.12)催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3-二磷酸甘油酸和NADH 生成 3-磷酸甘油醛、无机磷和 NAD+,340nm 处测定 NADH 的减少量可反映 GAPDH 活性的高低。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液) 进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心 20min,取上清,置冰上待测。
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴, 功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆):直接检测。
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 操作表(在微量石英比色皿或 96 孔板中分别加入下列试剂):
试剂名称 |
空白管 |
测定管 |
样本(µL) |
|
6 |
蒸馏水(µL) |
6 |
|
试剂三(µL) |
4 |
4 |
工作液(µL) |
190 |
190 |
在微量石英比色皿/96 孔UV 板中分别加入上述试剂,充分混匀后于340nm 处测定10s 时的吸光值A1, 迅速置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)水浴或培养箱 5min(酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或 25℃),拿出迅速擦干测定 5min10s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。(空白管只需做 1-2 次) |
A、按石英比色皿计算:
(1) 按蛋白浓度计算酶活定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T=1072×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算酶活定义:每 g 组织每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)÷T=1072×ΔA÷W
(3) 按照细菌或细胞数量计算酶活定义:每 104 个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.14×ΔA
(4) 按液体体积计算酶活定义:每 mL 样本每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷V 样÷T=1072×ΔA
ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/ mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积,0.0002L;V 样:反应体系中样本体积,0.006mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度需自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间:5min;500:细菌或细胞总数,500 万;109:单位换算系数, 1mol=109nmol。
B、按 96 孔 UV 板计算:
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 孔板光径)进行计算即可。
1、 当 A1 小于 0.8 或 ΔA 大于 0.7 时(96 孔板为 A1 小于 0.4 或 ΔA 大于 0.4),建议将样本稀释后再进行测定。
2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.02。
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