货号:UPLC-MS-4463 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4462 | 规格:50T/48S |
紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液一 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
提取液二 |
液体 1.1 mL×1 支 |
-20℃保存 |
试剂一 |
液体 15 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 5 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
粉剂×3 支 |
-20℃保存 |
试剂四 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、试剂三:临用前取 1 支加入 0.833 mL 蒸馏水溶解,现配现用。-20℃分装保存;-20℃保存一周;
2、试剂四:临用前加入 3 mL 蒸馏水溶解,现配现用。-20℃分装保存;-20℃保存一周。
在干旱、盐渍化、重金属、紫外线等不同的胁迫条件下,均会诱导植物体内脯氨酸的积累,对植物起到保护作用。高等植物中,脯氨酸的合成有两条途径,分别以谷氨酸和鸟氨酸为前体。谷氨酸途径主要负责胁迫条件下脯氨酸的积累,而鸟氨酸途径主要在氮充足条件下起作用,与胁迫情况下脯氨酸的积累没有关系。
1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶,P5CS 是一个双功能酶,在 NADPH 和 ATP 作用下,可催化谷氨酸磷酸化及谷氨酸 γ-半醛还原,通过测定 NADPH 在 340 nm 处吸光度的变化,可计算出 P5CS 的活性高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
组织样本:按质量(g)︰提取液体积(mL)1︰5~10 比例(建议称取 0.1 g 样本,加入 1.0 mL 提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后加入 10 μL 提取液二,于 4℃,8000 rpm,离心 15 min,弃沉淀,取上清液置于冰上待测。
1、 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂三、试剂四置于冰上待测。
3、 操作表:(在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中操作)
试剂名称(μL) |
空白管 |
测定管 |
蒸馏水 |
20 |
|
样本 |
|
20 |
试剂一 |
120 |
120 |
试剂二 |
20 |
20 |
试剂三 |
20 |
20 |
试剂四 |
20 |
20 |
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂,充分混匀后于 340 nm 处测定 10s 时的吸光值 A1,迅速置于 37℃水浴锅/37℃培养箱放置 5min(酶标仪有控温功能的将温度调制37℃),拿出迅速擦干测定 5min10s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。 |
注意:空白管只需测定 1-2 次。
三、P5CS 酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADPH 为一个酶活单位。P5CS 酶活(U/mg prot)=ΔA÷ε÷d×V 反总×109÷(V 样×Cpr)÷T =321.54×ΔA÷Cpr÷d
2、按样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol NADPH 为一个酶活单位。
P5CS 酶活(U/g 质量)= ΔA÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T =324.76×ΔA÷W÷d
ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:微量比色皿光径,1 cm/96 孔 UV 板光径,0.6 cm;V 反总: 反应体系总体积,2×10-4L;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,0.02 mL;V 样总: 加入提取液体积,1.01 mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5 min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
1、当 A1 测定高于 1.5 或者 ΔA 大于 0.5 时,建议将样本稀释后检测,并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、尽量使用新鲜样本进行检测,操作时请置于冰上操作。
3、ΔA 空白管的数值一般不超过 0.05。
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