货号:UPLC-MS-4347 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4346 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 50 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 40 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 360 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存;
2、 试剂三:临用前加入 327 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存。
MDH(EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一, 催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心弃上清,按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约 0.05g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。血清(浆)样本:直接检测。
1、紫外分光光度计提前预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、试剂一37℃预热15min。
3、样本测定:
试剂名称(µL) |
测定管 |
空白管 |
样本 |
20 |
- |
蒸馏水 |
- |
20 |
试剂一 |
760 |
760 |
试剂二 |
10 |
10 |
试剂三 |
10 |
10 |
将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中,充分吸打混匀后立即在 340nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应1min 后的吸光度 A2,尽量保持反应温度为 37℃。计算 ΔA=A1-A2。记录 ΔA 测定、ΔA 空白。(空白管测 1-2 管即可)
单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(U/mL)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T =6431×(ΔA测定-ΔA空白)
2. 组织中NAD-MDH活力的计算
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(U/mg prot)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷Cpr
(2) 按样本质量计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(U/g 质量)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白)÷W
3. 细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(U/mg prot)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷Cpr
(2) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(U/104 cell)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本)÷T=13×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总:反应总体积,0.8mL;V样本:加入样本体积,0.02mL;V提取:提取液体积,1mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×10-3mL/nmol/cm;d:比色皿光径,1cm;T:反应时间,1min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;500: 细菌或细胞密度,500万/mL;W:样本质量,g。
1、 粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操做完成,以防止酶变性失活。
2、 实验时,试剂二、试剂三和样本在冰上放置,以免变性和失活。
3、 当初始读值小于 0.7 或者 ΔA 大于 0.5 时建议稀释后测量。
4、 建议一人加样一人比色。
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