货号:UPLC-MS-4367 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4366 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 70 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 40 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 支 |
4℃保存 |
试剂四 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 20 mL 提取液充分溶解备用;
2、 试剂三:临用前每支加 1 mL 双蒸水充分溶解备用;
3、 试剂四:用时每支加 500 μL 双蒸水充分溶解备用;
4、 工作液:在 15 mL 试剂二中加入 2 mL 试剂三和 1 mL 试剂四,可以根据比例现用现配。
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。NAD-ME催化NAD+还原成NADH,在340nm下测定NADH增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞或组织样本的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
1、 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中保温15min左右。
3、 操作表:
试剂名称(μL) |
测定管 |
试剂一 |
600 |
工作液 |
270 |
样本 |
30 |
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,混匀后在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种),340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 5min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。
1、组织中NAD-ME活力的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=965×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T =965×ΔA÷W
2、细菌或细胞中NAD-ME活力的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=965×ΔA÷Cpr
(2) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=1.93×ΔA
3、血清中NAD-ME活力的计算:
单位的定义:每mL血清在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T =965×ΔA
V反总:反应体系总体积,9×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样: 加入样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W: 样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
1、 若A2-A1大于0.5,需将样本用提取液稀释,使A2-A1小于0.5,可提高检测灵敏度。
2、 实验时,样本在冰上放置,以免变性和失活。试剂一在37℃或25℃水浴放置。
3、 在比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放入此烧杯中。
4、 最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
5、注意:如果ΔA<0.01,可将反应时间延长到10分钟。
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