2、 将试剂一在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中保温15min左右。

3、 操作表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，混匀后在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种），340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 5min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

三、NAD-ME 活性计算

1、组织中NAD-ME活力的计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=965×ΔA÷Cpr

（2） 按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T =965×ΔA÷W

2、细菌或细胞中NAD-ME活力的计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=965×ΔA÷Cpr

（2） 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=1.93×ΔA

3、血清中NAD-ME活力的计算：

单位的定义：每mL血清在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T =965×ΔA

V反总：反应体系总体积，9×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样： 加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1、 若A2-A1大于0.5，需将样本用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

2、 实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一在37℃或25℃水浴放置。

3、  在比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放入此烧杯中。

4、 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

5、注意：如果ΔA＜0.01，可将反应时间延长到10分钟。