货号:UPLC-MS-4529 | 规格:100T/48S | 微量法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂一 |
液体 5 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂二 |
液体 100 μL×1 支 |
2-8℃保存 |
试剂三 |
液体 4 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂四 |
液体 0.25mL×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:使用前先离心再吹打混匀。根据样本量将试剂二用蒸馏水稀释 10 倍后使用,当天用完。
2、 试剂四:根据样本量将试剂四用蒸馏水稀释 5 倍后使用,当天用完。
SOD(EC 1.15.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化超氧化物阴离子发生歧化作用,生成 H2O2 和O2。SOD 不仅是超氧化物阴离子清除酶,也是H2O2 主要生成酶,在生物抗氧化系统中具有重要作用。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O -),O -可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜,后者在 560nm处有吸收;SOD 可清除O -,从而抑制了甲臜的形成;反应液蓝色越深,说明SOD 活性愈低,反之活性越高。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、细胞超声破碎仪、研钵/ 匀浆器、冰和蒸馏水。
3. 血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 560nm,蒸馏水调零。
2. 测定前将试剂一、三和四 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min 以上。
3. 样本测定(按顺序在 96 孔板或加入下列试剂)
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
空白管 1 |
空白管 2 |
样 本 |
20 |
20 |
- |
- |
试剂一 |
45 |
45 |
45 |
45 |
试剂二 |
20 |
- |
20 |
- |
试剂三 |
35 |
35 |
35 |
35 |
蒸馏水 |
70 |
90 |
90 |
110 |
试剂四 |
10 |
10 |
10 |
10 |
充分混匀,37℃水浴 30min 后,560nm 处测定各管吸光值 A。计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白。如底部有沉淀,混匀后再行测定。(空白管 1 和空白管 2 各只需做 1~2 管;每个样本有一个对照管)
1、抑制百分率的计算
抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%
尽量使样本的抑制百分率在 30-70%范围内,越靠近 50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于 30%或大于 70%,则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需适当稀释样本;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需重新准备浓度比较高的待测样本或者提高操作表中样本体积,同时减少相同的蒸馏水体积。
2、SOD 酶活性单位:在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为 50%时,反应体系中的 SOD 酶活力定义为一个酶活力单位。
3、SOD 酶活性计算:
(1) 血清(浆)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V 反总] ÷V 样×F
=10×抑制百分率÷(1 -抑制百分率) ×F
(2) 组织、细菌或培养细胞 SOD 活力计算:
a. 按样本蛋白浓度计算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V 反总] ÷(V 样×Cpr)×F
=10×抑制百分率÷(1 -抑制百分率) ÷Cpr×F
b. 按样本质量计算
SOD 活性(U/g 质量)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V 反总] ÷(W×V 样÷V 样总)×F
=10×抑制百分率÷(1 -抑制百分率) ÷W×F
c. 按细菌或细胞数量计算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V 反总] ÷(500×V 样÷V 样总)×F
=0.02×抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×F
V 反总:反应总体积,0.2mL;V 样:加入反应体系中的样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积 1mL; Cpr:蛋白样本浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万;F:样本稀释倍数。
1、 样本和试剂二使用时在冰上放置。
2、 样本较多时,可按表格配制测定管工作液和对照管工作液(包含试剂一、(二)、三、蒸馏水),试剂四必须最后加入。
3、 反应完成后,可能有沉淀生成,混匀后
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