货号:UPLC-MS-4545 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4544 | 规格:50T/48S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 12 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 8 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 8 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂四 |
液体 14 mL×1 瓶(自备) |
4℃保存 |
标准品 |
液体 0.5mL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂四:自备氯仿;
2、 标准品:10μmol/mL 亚硝酸钠。
生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用,但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用,导致机体细胞和组织代谢异常,从而引起多种疾病。超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO -,NO -在对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺盐酸盐的作用下,生成紫红色的偶氮化合物,在 530nm 有特征吸收峰,根据 A530 值可以计算样本中 O -含量。
最低检出限:0.001451 μmol/mL
线性范围:0.0019-0.5 μmol/mL
需自备的仪器和用品:
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、研钵/匀浆器、微量玻璃比色皿/96 孔板、氯仿和蒸馏水。
1. 植物、动物组织:称取约 0.1g 样本,加入提取液 1mL,充分研磨,12000rpm,4℃,离心 20min,取 20μL 上清测定蛋白含量,其余上清作为待测样本。
2. 血清或培养液:直接测定。
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空白管 |
测定管 |
标准管 |
标准溶液(μL) |
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40 |
样本(μL) |
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40 |
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提取液(μL) |
100 |
60 |
60 |
试剂一(μL) |
80 |
80 |
80 |
混匀,37℃水浴 20min |
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试剂二(μL) |
60 |
60 |
60 |
试剂三(μL) |
60 |
60 |
60 |
混匀,37℃水浴 20min |
|||
试剂四(μL) |
100 |
100 |
100 |
混匀,8000rpm,25℃,离心 5min,小心吸取上层水相 200μL,蒸馏水调零,微量玻璃比色皿/96 孔板,测定 530nm 处吸光值,计算∆A 标准=A 标准管-A 空白管,∆A 样本=A 测定管-A 空白管。(空白管只需做 1-2 次) |
1. 标准曲线的绘制:以∆A 标准为 y 轴,标准溶液浓度为 x 轴,绘制标准曲线 y=kx+b。
2. 超氧阴离子含量的计算:将∆A 样本带入方程得到 x 值(μmol/mL)。
(1) 按照样本质量计算
超氧阴离子含量(μmol/g 质量)=2x×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W)=2x÷W
超氧阴离子产生速率(μmol/min/g 质量)=2x×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W)÷T=0.1x÷W
(2) 按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量(μmol/mg prot)=2x×V 样本÷(V 样本×Cpr)=2x÷Cpr
超氧阴离子产生速率(μmol/min/mg prot)=2x×V 样本÷(V 样本×Cpr)÷T=0.1x÷Cpr
(3) 按照血清或培养液体积计算
超氧阴离子含量(μmol/mL)=2x
超氧阴离子产生速率(μmol/min/mL)=2x÷T=0.1x
V 样本:参与反应样本体积,0.04mL;V 提取:提取过程中加入的提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,20min。
1、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
2、 样本制备好后,立刻进行测定,请勿将样本进行长时间的低温保存,以免影响测定结果。
3、 试剂四有一定的毒性,请操作时做好防护措施。
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