超氧阴离子含量检测试剂盒-植物试剂盒-超氧阴离子试剂盒



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货号:UPLC-MS-4545 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4544 规格:50T/48S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 110 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 12 mL×1

4℃保存

试剂二

液体 8 mL×1

4℃保存

试剂三

液体 8 mL×1

4℃保存

试剂四

液体 14 mL×1 瓶(自备)

4℃保存

标准品

液体 0.5mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂四:自备氯仿;

2 标准品:10μmol/mL 亚硝酸钠。

产品说明:

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用,但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用,导致机体细胞和组织代谢异常,从而引起多种疾病。超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO -,NO -在对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺盐酸盐的作用下,生成紫红色的偶氮化合物,在 530nm 有特征吸收峰,根据 A530 值可以计算样本中 O 含量。

技术指标:

最低检出限:0.001451 μmol/mL

线性范围:0.0019-0.5 μmol/mL

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、研钵/匀浆器、微量玻璃比色皿/96 孔板、氯仿和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 植物、动物组织:称取约 0.1g 样本,加入提取液 1mL,充分研磨,12000rpm,4℃,离心 20min,取 20μL 上清测定蛋白含量,其余上清作为待测样本。

2. 血清或培养液:直接测定。

二、测定步骤:

1. 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 530nm,蒸馏水调零。

2. 标准溶液的制备

取适量亚硝酸钠标准液,将其稀释为 0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125μmol/mL 的标准溶液,用这些标准管做标准曲线。

3. 操作表

 

空白管

测定管

标准管

标准溶液(μL

 

 

40

样本(μL

 

40

 

提取液(μL

100

60

60

试剂一(μL)

80

80

80

混匀,37℃水浴 20min

试剂二(μL

60

60

60

试剂三(μL

60

60

60

混匀,37℃水浴 20min

试剂四(μL

100

100

100

混匀,8000rpm25℃,离心 5min,小心吸取上层水相 200μL,蒸馏水调零,微量玻璃比色皿/96 孔板,测定 530nm

处吸光值,计算∆A 标准=A 标准管-A 空白管,∆A 样本=A 测定管-A 空白管。(空白管只需做 1-2 次)

三、超氧阴离子含量计算公式:

1. 标准曲线的绘制:以∆A 标准为 y 轴,标准溶液浓度为 x 轴,绘制标准曲线 y=kx+b。

2. 超氧阴离子含量的计算:将∆A 样本带入方程得到 x 值(μmol/mL)。

(1) 按照样本质量计算

超氧阴离子含量(μmol/g 质量)=2x×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W)=2x÷W

超氧阴离子产生速率(μmol/min/g 质量)=2x×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W)÷T=0.1x÷W

(2) 按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量(μmol/mg prot)=2x×V 样本÷(V 样本×Cpr)=2x÷Cpr

超氧阴离子产生速率(μmol/min/mg prot)=2x×V 样本÷(V 样本×Cpr)÷T=0.1x÷Cpr

(3) 按照血清或培养液体积计算

超氧阴离子含量(μmol/mL)=2x

超氧阴离子产生速率(μmol/min/mL)=2x÷T=0.1x

V 样本:参与反应样本体积,0.04mL;V 提取:提取过程中加入的提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,20min。

注意事项:

1 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

2 样本制备好后,立刻进行测定,请勿将样本进行长时间的低温保存,以免影响测定结果。

3 试剂四有一定的毒性,请操作时做好防护措施。


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