货号:UPLC-MS-4561 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4560 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 0.6 mL×1 支 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 1.5 mL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:液体置于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前加入 6 mL 蒸馏水溶解,4℃可保存 1 个月。
DAO (EC1.4.3.6)广泛存在于动物(肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等)、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛,其活性与核酸和蛋白合成密切相关,能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。
DAO 催化尸胺产生醛和过氧化氢,外源添加过量的辣根过氧化物酶,催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成有色物质,在 500nm 处有特征吸收峰,通过测定该波长吸光度增加速率,计算 DAO 活性。
需自备的仪器和用品:
天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇、研钵/匀浆器、水浴锅。
|
对照管 |
测定管 |
样本(mL) |
0.25 |
0.25 |
提取液(mL) |
0.59 |
0.59 |
试剂一(mL) |
0.01 |
0.01 |
试剂二(mL) |
0.1 |
0.1 |
试剂三(mL) |
- |
0.05 |
无水乙醇(mL) |
0.05 |
- |
混匀,37℃水浴 30min 后于 1mL 玻璃比色皿中测定 500nm 下吸光度,ΔA=A 测定-A 对照。 |
1、组织 DAO 活力的计算
(1) 按蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1μmol 氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。
DAO(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(Cpr×V 样本)÷T=18×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1μmol 氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。
DAO(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W÷V 提取×V 样本)÷T=18×ΔA÷W
2、血清(浆)DAO 活力的计算
单位的定义:每 mL 血清(浆)在反应体系中每分钟催化产生 1μmol 氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。
DAO(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样本÷T=18×ΔA 3、按细胞数量计算
单位的定义:每 104 个细胞在反应体系中每分钟催化产生 1μmol 氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。
DAO(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(500÷V 提取×V 样本)÷T=0.036×ΔA
ε:氧化型邻联茴香胺消光系数,7.5×10-3mL/μmol/cm;d:1mL 玻璃比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积, 1mL;V 样本:加入样本的体积,0.25mL;V 提取:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W: 样本质量,g;T:反应时间,30min;500:细胞总数,500 万。
1、 如果 ΔA 小于 0.01,适当加大提取用样本质量;ΔA 大于 0.8,样本可用提取液适当稀释,或者减少提取用样本质量。
2、 样本蛋白质含量需要另外测定。
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