货号:UPLC-MS-4263 | 规格:100T/96S | 微量法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 25 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂四 |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂三:临用前加入 0.5 mL 蒸馏水充分溶解待用,振荡溶解后若出现浑浊可以离心使用;
2、 试剂四:临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解待用;
3、 工作液的配制:临用前在试剂二中加入全部试剂一,充分混匀,在 25℃孵育 5min。
1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco, EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶,既控制着CO2的固定, 同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流,其活性的大小直接影响着光合速率。
在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA); PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,伴随着NADH氧化生成NAD+;在340 nm NADH有特征吸收峰,而NAD+没有此吸收峰,因此测定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco 的羧化酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
1、细菌或细胞样本的制备:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、称取约 0.1g 组织加入 1mL 提取液,冰浴中匀浆。10000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。建议选取新鲜的植物样本。
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、按下表步骤加样:
试剂名称 |
测定管 |
空白管 |
样本(μL) |
20 |
- |
蒸馏水(μL) |
- |
20 |
试剂三(μL) |
7 |
7 |
试剂四(μL) |
7 |
7 |
工作液(μL) |
180 |
180 |
记录 340nm 处 20s 时吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定=A1 测定-A2 测定,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白,ΔA =ΔA 测定-ΔA 空白。反应温度保持在 25℃。(空白管只做 1-2 管)
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。Rubisco活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T =344×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
单位的定义:25℃中每 g 组织每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T=344×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞数量计算
单位的定义:25℃中每1万个细菌或细胞每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。Rubisco活力(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=0.69×ΔA
V反总:反应体系总体积,2.14×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
将上述公式中光径d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到