谷氨酸脱氢酶(GDH)活性检测试剂盒-植物试剂盒-谷氨酸脱氢酶试剂盒




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货号:UPLC-MS-4442  规格:50T/48S  紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 60 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 60 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

-20℃保存

溶液的配制:

工作液的配制:临用前将试剂一加入试剂二中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min。

产品说明:

GDH(EC 1.4.1.2)广泛分布于植物中,和谷氨酸合成酶(GOGAT)共同参与谷氨酸的合成,在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

GDH催化NH +、α-酮戊二酸和NADH,生成谷氨酸和NAD+,引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率,计算GDH活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者

增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次);8000g 4℃离心 10 分钟,取上清,置冰上待测。

2、称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10 分钟,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2. 样本测定:

取1mL工作液和0.05mL样本于光径为1 cm的1mL石英比色皿中,混匀,加样本的同时开始计时,在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。

三、GDH 活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=675×ΔA÷Cpr


2. 按样本质量计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=675×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=1.35×ΔA

V反总:反应体系总体积,1.05×10-3L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W 样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项:

1. 当ΔA大于0.5时,将样本进行稀释后测量。

2. 由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。


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