二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 485nm，可见分光光度计用乙酸乙酯调零。

2、 标准溶液的稀释：

（1） 临用前取 10μL 10mg/mL TTC 标准液，加入 1990μL 试剂二，充分混匀，配制成 50μg/mL TTC 标准溶液，现用现配。（后续实验需要 1000μL，为减小实验误差，故配制大体积。）

（2） 取 1mL 50 μg/mL TTC 标准溶液加入到一支试剂三内，充分震荡混匀 2min。混匀后加入 1mL 乙酸乙酯，再次充分震荡混匀 2min，室温静置分层 5min，取上层溶液。

（3） 将上层溶液用乙酸乙酯进行稀释，得到 12.5μg/mL 标准溶液备用（吸取 250μL 50 μg/mL TTC 加入 750μL乙酸乙酯混匀即可）。

3、标准溶液的测定

取 1000μL 12.5μg/mL 标准溶液和 1000μL 乙酸乙酯（即 0μg/mL）于玻璃比色皿中，分别测定其在 485nm 处的吸光度。计算 ΔA 标准= A（12.5μg/mL）-A（0μg/mL）。ΔA 标准只需做 1-2 次。

4、在 5mLEP 管中按下表步骤加样：

充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至于离心管中，12000 rpm/min，4℃，离心 10min，取 1mL 上清至玻璃比色皿中，测定 485nm 下的吸光值。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照（每一个测定管对应一个对照管）。ΔA 测定的测定范围在 0.005-1.5 之间。

三、根系活力计算

2. 按照样本质量计算

按照样本质量计算根系活力：以 TTC 的还原量来表示根系活力

TTC 还原强度 [ μg TTC/(g·h) ] =ΔA 测定×C 标÷ΔA 标准×V÷ (W×T)=6.25×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

W：根重，g；C 标：标准溶液浓度，12.5μg/mL；T：反应时间，4h；V：试剂四的体积即匀浆体积，2mL。

注意事项：

1、 试剂四容易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。

2、 若样品 37℃暗反应未到 4h 但根系已出现深粉色，此时可以直接进行下一步实验操作；若 ΔA 测定大于 1.5， 可以减少样本质量或者缩短反应时间进行实验，计算公式注意修改。

3、 若 4h 暗反应结束后，根系没有出现粉色或者 ΔA 测定小于 0.005，可以延长暗反应时间（8h，16h 甚至 24h） 或者加大样品量，计算公式注意修改。

4、 如果离心后待测的上清依然浑浊，可尝试加大离心转速或者延长时间，例如 15000rpm 4℃离心 20min。