土壤多酚氧化酶(S-PPO)活性检测试剂盒




试剂名称

规格

保存条件

试剂一

粉剂×2

2-8℃保存

试剂二

液体 5 mL×1

2-8℃保存

试剂三

液体 50 mL×1 瓶(自备)

2-8℃保存

标准液

液体 10 mL×1

2-8℃保存

溶液的配制:

1 试剂一:临用前取 1 瓶加入 7 mL 蒸馏水,用不完的试剂 2-8℃保存 2 周;

2 试剂三:自备乙醚;

3 标准液:重铬酸钾溶液(5 mmol/L),相当于 0.2 mg/mL 紫色没食子素溶液。

产品说明:

S-PPO 主要来源于土壤微生物、植物根系分泌物及动植物残体分解释放,催化土壤中芳香族化合物氧化成醌, 醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成有机质和色素,完成土壤芳香族化合物循环,用于土壤环境修复。

S-PPO 能够催化邻苯三酚产生紫色没食子素,后者在 430nm 有特征光吸收。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板(非聚苯乙烯材质)、乙醚(不允许快递)、30~50 目筛、0.5mol/L HCL 溶液、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、 样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 

新鲜土样自然风干或 37℃烘箱风干,过 30~50 目筛。

二、测定步骤

1、可见分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 430nm,可见分光光度计试剂三调零。

2、标准液稀释:用 0.5mol/L HCL 溶液将标准液稀释至 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0 mg/mL。

3、标准液稀释表:


序号

稀释前浓度(mg/mL

标准液体积(µL

0.5mol/L HCl 体积(µL

稀释后浓度(mg/mL

1

0.2

1000

0

0.2

2

0.2

500

500

0.1

3

0.1

500

500

0.05

4

0.05

500

500

0.025

5

0.025

500

500

0.0125

6

0.0125

500

500

0.00625

7

0.00625

500

500

0.003125

8

0.003125

0

500

0

备注:实验中每个标准管需 200µL 标准溶液。

4、标准曲线的建立:以 0 mg/mL 的标准液调零,取 200µL 稀释好的标准液于微量玻璃比色皿/96 孔板中在 430nm处测定吸光值A,根据吸光度(x)和浓度(y,mg/mL)做出标准曲线。

5、样本测定表(1.5mLEP 管)

试剂名称

测定管

风干土样(g

0.02

试剂一(μL

120

振荡混匀,30℃水浴反应 1h

试剂二(μL

50

试剂三(μL

430

振荡数次,室温静置 30min,取 200μL 上层液于微量玻璃比色皿/96 孔板中,430nm 处测定吸光值A。三、S-PPO 活性计算

根据标准曲线,将样本吸光值A 带入公式中(x),计算出样本浓度 y(mg/mL)。单位的定义:每天每g 土样中产生 1mg 紫色没食子素定义为一个酶活力单位。

S-PPO(U/g 土样)=y×V 提取相÷W÷T =516×y

T:反应时间,1h=1/24d;V 提取相:提取相总体积,0.43mL;W:样本质量,0.02g。

注意事项:

乙醚易挥发,转移至酶标板时建议一次性不要测定太多样本。


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