货号：UPLC-MS-4050 规格：50T/48S 可见分光光度法
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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试剂一 |
液体 42 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂三 |
液体 5 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂四 |
粉剂×2 支 |
2-8℃保存 |
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标准品 |
液体 1 mL×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入 100mL 蒸馏水充分溶解，2-8℃保存 8 周；
2、 试剂四：临用前加入 576μL 无水乙醇（自备），24μL 蒸馏水充分溶解，试剂变褐色后不能再使用，2-8℃可保存 2 周（为延长试剂盒使用效期，故多给一瓶）；
3、 标准品：0.5μmol/mL 苯酚标准液。
土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和 pH 显著影响，根据最适 pH 范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。中性环境中，S-NP 催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出 S-NP 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水、乙醇、30~50 目筛和甲苯。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 1. 新鲜土样自然风干或 37℃烘箱风干，过 30~50 目筛。
2. 称取风干混匀土壤约 0.1g，加入 0.05mL 甲苯（自备），轻摇 15min；然后再加入 0.4mL 试剂一并且充分摇匀，置于 37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应 24h；到时后取出并迅速加入 1mL 试剂二，充分混匀，以终止酶催化的反应。10000rpm，25℃离心 10min，取上清液置于冰上待测。
1. 可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长到 660nm，分光光度计用蒸馏水调零。
2. 空白管：取微量玻璃比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 试剂一，40μL 试剂三，4μL 试剂四，充分混匀，显色后再加 146μL 蒸馏水，混匀后室温静置 30min，于 660nm 测定吸光度，记为 A 空白管。
3. 标准管：取微量玻璃比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 标准液，40μL 试剂三，4μL 试剂四，充分混匀，显色后再加 146μL 蒸馏水，混匀后室温静置 30min，于 660nm 测定吸光度，记为 A 标准管。
注：空白管和标准管只需要测定 1-2 次。
4. 测定管：取微量玻璃比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 上清液，40μL 试剂三，4μL 试剂四，充分混匀，显色后再加 146μL 蒸馏水，混匀后室温静置 30min，于 660nm 测定吸光度，记为 A 测定管。
活性单位定义：37℃中每克土壤每天释放 1nmol 酚为 1 个酶活单位。
S-NP（U/g 土样）=[C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×1000×V 总÷W÷T
=725×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
C 标准液：0.5μmol/mL；V 总：催化体系总体积，1.45mL；W：土壤样本质量，g；T：催化反应时间，24h=1d；
1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol。
测定期间请将样本在冰上放置，以免酶变性或失活。
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