1. 样品及指标信息
样品：液体样本1份
指标：巯基
2. 实验方法简介
生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质，而且参与活性氧清除，后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和 GSH 含量，能够间接测定蛋白质巯基含量。
巯基基团与 5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在 412nm 处有最大吸收峰。
Sulfhydryl Group + 5, 5,- Dithiobis-2-Nitrobenoic acid 2-Nitro-5-Mercaptobenzoic Aicd (412nm)
3. 主要试剂
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
0.01MPBS 60 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
|
试剂一 |
0.1M PBS 20 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂二 |
DTNS溶液 1 mL×1 支 |
2-8℃保存 |
|
标准品 |
半胱氨酸×1 支 |
2-8℃保存 |
4. 仪器和设备
1. 可见分光光度计/酶标仪。
2. 水浴锅。
3. 可调式移液器。
4. 微量比色皿/96 孔板。
5. 试样制备
液体样本：直接测定。不浓度过高，可以用蒸馏水稀释上样，若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。
6. 分析步骤
1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。
2. 标准液的稀释：将25μmol/mL标准溶液用蒸馏水稀释至0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μmol/mL的标准液，现用现配。
3. 操作表
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试剂名称 |
对照管 |
测定管 |
标准管 |
空白管 |
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样本（μL） |
40 |
40 |
- |
- |
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标准品（μL） |
- |
- |
40 |
- |
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试剂一（μL） |
150 |
150 |
150 |
150 |
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试剂二（μL） |
- |
10 |
10 |
- |
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H2O（μL） |
10 |
- |
- |
50 |
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混匀，室温准确静置10min，测定412nm吸光值，分别记为A对照、A测定、A标准、A空白，并计算ΔA 标准= A标准-A空白、ΔA测定= A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2 次。 |
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7. 结果计算
1、标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（y，µmol/mL）和吸光度ΔA标准（x，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（x，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（y，μmol/mL）。
2、总巯基含量计算：
（1） 按样本质量计算：总巯基含量（μmol/g 质量）=y×V样总÷W=x÷W
（2） 按样本蛋白浓度计算：总巯基含量（μmol/mg prot）=y×V样总÷（Cpr×V样总）=y÷Cpr
（3） 按血清、培养液体积计算：总巯基含量（μmol/L）=y×V样÷（V样×10-3）=1000y
V样总：加入提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.04mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL；10-3：单位换算系数，1mL=10-3L。
如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。
8. 实验结果与分析
见附件（Excel表格）
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