货号:UPLC-MS-4477 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4476 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 55mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 20mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂四 |
液体 4mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
液体 1mL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前加入 4mL 蒸馏水,充分溶解。
2、 试剂二:临用前加入 4mL 提取液,沸水浴中搅拌溶解。
3、 标准品:20μmol/mL 标准酪氨酸。
NP 在一定的温度和中性 pH 条件下,催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点, 中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。中性条件下,NP 催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在 680nm 有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP 管、冰和蒸馏水。
称约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心 10min,取上清,即粗酶液,置冰上待测。或直接称取 0.1g 酶制品,加入 1mL 提取液,置冰上待测。
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至680nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一、试剂二和试剂三置于30℃水浴保温30min以上。
3、 标准溶液的配制:临用前将20μmol/mL标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/mL标准溶液使用,现用现配。
4、 样本测定 (1.5mLEP管中分别加入下列试剂) :
试剂名称(µL) |
对照管 |
测定管 |
空白管 |
标准管 |
粗酶液 |
20 |
20 |
|
|
试剂一 |
40 |
|
||
试剂二 |
|
40 |
||
混匀后30℃水浴保温10min |
||||
试剂一 |
|
40 |
||
试剂二 |
40 |
|
||
混匀后10000rpm 4℃离心10min,取上清 |
||||
上清 |
40 |
40 |
|
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蒸馏水 |
|
|
40 |
|
标准品 |
|
|
|
40 |
试剂三 |
200 |
200 |
200 |
200 |
试剂四 |
40 |
40 |
40 |
40 |
混匀后30℃水浴保温20min。取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,分别记为A对照管、A测定管、A空白管、A标准管。并计算ΔA测定=A测定管-A对照管、ΔA标准=A标准管-A空白管。 |
1、按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1μmol 酪氨酸为一个酶活单位。
NP 活性(U/mg prot)=C 标准品×ΔA 测定÷ΔA 标准×V1÷(Cpr×V2)÷T =0.125×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活单位定义:30℃每克样本每分钟催化水解产生 1μmol 酪氨酸为一个酶活单位。
NP 活性(U/g 质量)=C 标准品×ΔA 测定÷ΔA 标准×V1÷(W×V2÷V3)÷T =0.125×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
C 标准品:标准酪氨酸溶液浓度,0.25 μmol/mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V1: 酶促反应总体积,0.1mL;V2:加入反应体系中粗酶液体积,20µL=2×10-2 mL;V3:粗酶液总体积,1mL;T:催化反应时间,10min。
若反应较弱,(A 测定管-A 对照管)差值较小,可适当延长反应时间(20-30min),即第一步水浴时间,最后计算酶活时对公式进行修改。
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