上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-5050	规格：100T/96S	微量法
货号：UPLC-MS-5049	规格：50T/48S	可见分光光度法

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取 1 瓶试剂二加入 7mL 蒸馏水，此试剂较难溶，可以在 70℃加热并剧烈振荡以促进溶解，或者通过超声处理以促进溶解。每次用前需检查是否有粉剂析出。用不完的试剂可在 2-8℃中保存一个月。

2. 标准品：为 1000nmol/mL 的标准溶液

产品说明：

脂质过氧化物（lipid hydroperoxide LPO）是不饱和脂肪酸链经自由基或活性氧作用后产生的过氧化物。病理情况下，脂质过氧化反应增强可导致原本低含量的 LPO 升高。LPO 含量升高会对细胞的结构和功能造成损伤， LPO 含量与机体免疫系统和衰老密切相关。

LPO 在酸性条件下加热产生丙二醛（MDA），MDA 与硫代巴比妥酸(Thiobarbituric  acid，TBA)缩合，生成棕红色物质三甲川（3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），其最大吸收波长在 532nm，进行比色后可估测样本中 LPO 的含量。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵/匀浆器/细胞超声波破碎仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照样本质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000:1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液）加入提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min），8000g 4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

3、培养液或其他液体：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 532nm 和 600nm，可见分光光度计需用蒸馏水调零。

2、标准溶液的制备：现标准液为1000nmol/mL的MDA标准溶液，将标准液用稀释液稀释至20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625nmol/mL备用，具体稀释可参考下表。

备注：实验中每个标准管需 120µL 标准溶液。

3、在EP 管中按下表步骤加样：将混合液在 45℃（植物样本）或 100℃（其他样本）水浴 60min 后（标准管在两个温度水浴均可），置于冰浴中冷却，8000g，常温，离心 10min。吸取 200μL 上清液于微量玻璃比色皿或 96 孔板中，测定各样本在 532nm 和 600nm 处的吸光度。分别计算 ΔA=（A532 测定-A532 对照）-（A600 测定-A600 对照），ΔA 标准=（A532 标准-A532 空白）-(A600 标准-A600 空白）（标准曲线，空白管和对照管只需做 1-2 次）。

三、LPO 含量的计算

1. 根据标准管的浓度（x，nmol/mL）和吸光度 ΔA 标准（y，ΔA 标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将 ΔA（y，ΔA）代入公式计算样本浓度（x，nmol/mL）

2. 按样本蛋白质浓度计算