货号:UPLC-MS-4432 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
货号:UPLC-MS-4432 | 规格:25T/24S | 紫外分光光度法 |
货号:UPLC-MS-4432 | 规格:10T/9S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
10T/9S 规格 |
25T/24S 规格 |
50T/48S 规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 15 mL×1 瓶 |
液体 30 mL×1 瓶 |
液体 60 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
粉剂×1 支 |
粉剂×2 支 |
粉剂×2 瓶 |
-20℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 支 |
粉剂×2 支 |
粉剂×2 瓶 |
-20℃保存 |
试剂三 |
液体 15 mL×1 瓶 |
液体 30 mL×1 瓶 |
液体 55 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂四 |
粉剂×1 支 |
粉剂×2 支 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
10T/9S 规格溶液的配制:
1. 试剂一:临用前取一支加入 1.25 mL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,禁止反复冻融。
2. 试剂二:临用前取一支加入 1.25 mL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,禁止反复冻融。
3. 试剂四:临用前取一支加入 500 μL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,禁止反复冻融。
25T/24S 规格溶液的配制:
1、 试剂一:临用前取一支加入 1.25 mL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,禁止反复冻融。
2、 试剂二:临用前取一支加入 1.25 mL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,禁止反复冻融。
3、 试剂四:临用前取一支加入 0.6 mL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,禁止反复冻融。
50T/48S 规格溶液的配制:
1. 试剂一:临用前取一支加入 2.5 mL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,禁止反复冻融。
2. 试剂二:临用前取一支加入 2.5 mL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,禁止反复冻融。
3. 试剂四:临用前取一支加入 1.25 mL 试剂三,充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存 2 周,禁止反复冻融。
脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase,FAS)是一种关于脂肪酸再生能力并起重要作用的限速酶,它通过催化丙二酰辅酶A、乙酰辅酶 A 和 NADPH 生成长链脂肪酸和 NADP+,NADPH 在 340nm 条件下有特征吸收峰。通过检测 340nm 条件下吸光值的下降速率,可以计算出 FAS 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、超声波细胞破碎仪、水浴锅/培养箱、低温离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
1、细菌、细胞样本的制备:按照细胞数量(104 个): 提取液体积(mL)为 500~1000 : 1 的比例(建议 500万细胞加入 1 mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300W,超声 3 秒,间隔 9 秒,总时间 5 min);于 4℃,12000 g离心 20 min,取上清液,置于冰上待测。
2、组织样本的制备:按照质量(g): 提取液一体积(mL)为 1: 5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,12000 g 离心 20 min,取上清液,置于冰上待测。
3、血清(浆)等液体样本:直接测定。
1、 紫外分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。
2、 试剂三临用前置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)中预热 15 min。
3、 加样表(在比色皿中加入下列试剂)
试剂名称 |
测定管 |
空白管 |
上清液 |
100 |
- |
蒸馏水 |
- |
100 |
试剂一 |
80 |
80 |
试剂二 |
80 |
80 |
试剂三 |
700 |
700 |
试剂四 |
40 |
40 |
迅速吹打混匀,记录第 15s 的吸光值 A1 测定(A1 空白),和 1min15s 时的吸光值 A2 测定(A2 空白), 计算 ΔA =(A1 测定-A2 测定)-(A1 空白-A2 空白)。 |
1、 计算公式
(1) 按照蛋白浓度计算
单位定义:在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)条件下,每毫克蛋白每分钟氧化 1 nmol NADPH 为 1 个酶活单位。
FAS (U/mg prot) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109] ÷(Cpr×V 样)÷T=1607.7×ΔA÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
单位定义:在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)条件下,每克组织每分钟氧化 1 nmol NADPH 为 1 个酶活单位。
FAS (U/g 质量) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1607.7×ΔA ÷W
(3) 按细胞数量计算
单位定义:在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)条件下,每 104 个细胞每分钟氧化 1 nmol NADPH 为 1个酶活单位。
FAS (U/104 cell) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=1607.7×ΔA ÷细胞数量
(4) 按液体体积计算
单位定义:在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)条件下,每毫升样本每分钟氧化 1 nmol NADPH 为 1个酶活单位。
FAS (U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷V 样÷T=1607.5×ΔA
ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V 反总:反应体系总体积,1000 μL=1×10-3L; Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g;V 样:加入反应体系中上清液体积,100 μL=0.1 mL;V 样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;细胞数量:以万计。
1、提取液中含有 BSA(约 2mg/mL),测定上清液蛋白浓度时需要减去提取液中蛋白浓度。
2、如果测定吸光值>1.2 或 ΔA>0.5,建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定,计算公式中乘稀释倍数。如果测定吸光值较小,建议加大样本量后再进行测定。
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