货号:UPLC-MS-4405 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4404 | 规格:50T/48S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
试剂一 |
液体 120 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 6 mL×1 瓶 |
常温保存 |
试剂三 |
液体 10 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
液体 59.3 μL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
标准品:临用前加入 1.435 mL 无水乙醇配成 125 µmol/mL 的油酸标准溶液,充分溶解。用前注意解冻溶解。
LPS又称甘油酯水解酶,催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油(或者甘油二酯和单酯)。LPS广泛的存在于各种生物中。血清中LPS的异常增高常见于胰腺炎和胰腺癌。
LPS催化油酯水解成脂肪酸,利用铜皂法测定脂肪酸生成速率,即可计算LPS活性。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/酶标板(非聚苯乙烯材质)、可调式移液枪、甲苯、无水乙醇、冰和蒸馏水。
组织样本:称取约 0.1g 样本,加试剂一 1.0mL 充分研磨,于 4℃,15000rpm 离心 30min,取上清液待测。血清样本:直接检测。
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至710nm,甲苯调零。
2、 试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min以上。
3、 标准溶液的稀释:将125µmol/mL的油酸标准溶液用乙醇稀释为125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9µmol/mL的标准溶液待测。
4、 操作表:
加入试剂(mL) |
空白管 |
测定管 |
标准管 |
试剂一 |
0.15 |
0.15 |
0.15 |
试剂二 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
反复震荡混匀 |
|||
蒸馏水 |
0.08 |
|
|
上清液/血清 |
|
0.08 |
|
标准溶液 |
|
|
0.08 |
迅速震荡混匀后置于37℃水浴准确反应10 min |
|||
甲苯 |
0.4 |
0.4 |
0.4 |
反复震荡混匀后,室温4000rpm离心10 min |
|||
取出离心管,小心吸取上层溶液0.3 mL,加入另一2 mL塑料离心管中,按下表操作 |
|||
试剂三 |
0.075 |
0.075 |
0.075 |
1、标准曲线的绘制:以油酸标准溶液浓度为横坐标,ΔA标准为纵坐标,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b。将ΔA测定带入方程,得到x(µmol/mL)。
2、酶活计算:
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/mg prot) =x×V样÷(Cpr×V样) ÷T= 0.1×x÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/g 质量) =x×V样÷(W×V样÷V提) ÷T= 0.1×x÷W
(3) 按血清计算
活性单位定义:37℃中每mL血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/mL 血清) =x÷T= 0.1×x
V样:加入反应体系中上清液体积,0.08mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL,需要另外测定;T:催化反应时间,10min;W:样本质量,g;V提:提取液体积,1mL。
1、 甲苯有毒,实验过程中需佩戴手套和口罩。
2、 实验过程中须远离火源。
3、 当吸光度大于1时,建议将样本稀释后测量。
4、 如果用酶标板进行试验,建议选用非聚苯乙烯材质的96孔板。
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