上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测,Elisa代测,HPLC 检测,GC检测,GC-MS 检测,LC-MS检测,ICP-MS检测 、土壤、植物、动物,成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号:UPLC-MS-5074 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-5073 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 5 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 4 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 瓶 |
-20℃保存 |
试剂四 |
粉剂×2 瓶 |
-20℃保存 |
试剂五 |
液体 40μL×1 支 |
4℃保存 |
试剂六 |
液体 5mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂七 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 提取液:临用前将试剂七加入到提取液中,勿放于-20℃;
2、 试剂三:临用前每瓶加入 2.5mL 蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,避免反复冻融;
3、 试剂四:临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,避免反复冻融;
4、 试剂五:使用前需先离心。根据用量按照试剂五:蒸馏水为 1:8 的体积比例充分混匀,现用现配;
5、 工作液配制:按试剂一:试剂二:试剂三:试剂四:试剂五=29:35:42:42:3的比例将各试剂混合后备用(共151μL,1T的量),根据样本数量现用现配。
ICL(EC4.1.3.1)主要存在于植物和微生物中,油料作物种子在萌发过程中,通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD,NADH在340nm下有特征吸收峰,监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。
2、组织处理:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。
1、组织中ICL活力的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/mg prot)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=2297×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/g 质量)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(W÷V提取×V样本) ÷T=2297×ΔA÷W
V反总:反应总体积,0.2×10-3L;V样本:加入样本体积,0.007mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm; d:微量石英比色皿光径,1cm;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V提取:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;T: 反应时间,2min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
2、细菌或培养细胞中ICL活力的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/mg prot)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=2297×ΔA÷Cpr
(2) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/104 cell)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(500÷V提取×V样本) ÷T=4.59×ΔA
V反总:反应总体积,0.2×10-3L;V样本:加入样本体积,0.007mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm; d:微量石英比色皿光径,1cm;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V提取:加入提取液体积,1mL;500:细菌或细胞数量,500万;T:反应时间,2min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
B. 用96孔板测定的计算公式如下
1、组织中ICL活力的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/mg prot)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=3828×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/g 质量)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(W÷V提取×V样本) ÷T=3828×ΔA÷W
V反总:反应总体积,0.2×10-3L;V样本:加入样本体积,0.007mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm; d:96孔UV板光径,0.6cm;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V提取:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;T: 反应时间,2min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
2、细菌或培养细胞中ICL活力的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/mg prot)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=3828×ΔA÷Cpr
(2) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/104 cell)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(500÷V提取×V样本) ÷T=7.65×ΔA
V反总:反应总体积,0.2×10-3L;V样本:加入样本体积,0.007mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm; d:96孔UV板光径,0.6cm;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V提取:加入提取液体积,1mL;500:细菌或细胞数量,500 万 ;T:反应时间,2min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。96 孔 UV 板测定时,不推荐同时测多个样本。
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