乙醇酸氧化酶(GO)活性检测试剂盒-乙醇酸氧化酶(GO)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4265 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4264 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 60 mL×2

4℃保存

试剂一

液体 15 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×2

-20℃保存

试剂三

液体 2 mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前加入 2.5 mL 双蒸水溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

产品说明:

乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是乙醇酸循环中的一种酶,也是植物光呼吸代谢中的关键酶,催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,通过测定乙醇酸氧化酶活性,可以了解植物光合和呼吸代谢的基本方法。

乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙,在 324nm 有特征吸收峰。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板UV板、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液 进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置冰上待测。

细胞或细菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min 取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至324nm,紫外分光光度计蒸馏水调零。

2. 将试剂一25℃预热15min。

3. 样本测定:在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂:

试剂名称

测定管

空白管

试剂一(μL

130

130

蒸馏水(μL

-

10

样本(μL

10

-

试剂二(μL

40

40

试剂三(μL

20

20

充分混匀,立即测定324nm10s190s吸光值A1A2,计算ΔA测定管=A2测定-A1测定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次)

三、GO 酶活计算

1 按微量石英比色皿计算:

       (1) 按蛋白浓度计算

酶活定义:每毫克蛋白每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。GO 酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×Cpr)÷T=392.16×ΔA÷Cpr

(2) 按样本质量计算

酶活定义:每克组织每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。

GO 酶活(U/g  质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×W÷V 样总)÷T=392.16×ΔA÷W

(3) 按细胞数量计算

酶活定义:每万细胞每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。GO 酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×500÷V 样总)÷T=0.784×ΔA

ε:乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数:17000L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积,2×10-4L;V 样:反应中样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,3min;500:500 万个细胞;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

2 96 UV 板计算:

将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 UV 板光径)进行计算即可。

注意事项:

1 测定之前进行预实验,若吸光值 A1>1,请将样本用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。

2 色素含量较高的样本,可在提取酶时加活性炭吸附。

3 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,其 OD 值变化不超过 0.02。


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