上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4611	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-4610	规格：50T/24S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、试剂三：临用前加入 6 mL 蒸馏水溶解备用，用不完的试剂 4℃保存；2-8℃保存 4 周。

2、标准品：9 µmol/mL 的亚铁离子标准液。

产品说明：

亚铁氧化酶（Hsphasetin，HP）是铜蓝蛋白的同系物，催化亚铁离子（Fe2+）氧化为三价铁离子（Fe3+），从而三价铁与转铁蛋白结合，参与细胞铁释放。

以一定浓度的 Fe2+ 为底物，在亚铁氧化酶的催化作用下 Fe2+ 被氧化为 Fe3+，Fe2+ 与菲咯嗪形成有色复合物， 在 562 nm 处有特征吸收峰，先计算出未被氧化的 Fe2+ 的含量，进而得出被氧化的 Fe2+ 的含量，可通过 Fe2+被氧化的速率来反映亚铁氧化酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/ 匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照质量（g）︰蒸馏水体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g，加入 1 mL 蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于 10000 rpm，4℃离心 10 min，取上清置于冰上待测。

2、血清或血浆：建议用蒸馏水将血清或血浆稀释 2~4 倍后直接检测。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 562 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 标准液的稀释：将9µmol/mL 的亚铁离子标准液用蒸馏水倍比稀释为360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的标准溶液备用。 

3、 标准液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需 40µL 标准溶液。

4、 操作表：在 1.5 mL 离心管（分光光度计）或 96 孔板中依次加入试剂。

三、亚铁氧化酶活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度（nmol/mL）为 x 轴，其对应的ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y= kx+b， 将ΔA 测定带入方程得到样本浓度（x，nmol/mL）。

2、 亚铁氧化酶活性的计算：

         （1） 按照样本蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 蛋白每分钟氧化 1 nmol 的 Fe2+ 定义为 1 个酶活力单位。

亚铁氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V 试剂二÷（V 样×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N

（2） 按照样本质量计算