上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4327	规格：100T/96S	微量法
货号：UPLC-MS-4326	规格：50T/48S	紫外分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

试剂三：易挥发试剂，使用后尽快拧紧盖子放入-20℃保存。

产品说明：

顺乌头酸酶（Aconitase, ACO）是细胞内一种重要的铁硫蛋白酶，主要存在于胞浆与线粒体中。ACO 催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸的可逆反应，对维持三羧酸循环及乙醛酸循环的顺利进行起着重要作用。

顺乌头酸酶催化异柠檬酸生成顺乌头酸，顺乌头酸在 240nm 有特征吸收峰，通过检测顺乌头酸的产生速率来计算该酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、顺乌头酸酶的提取：（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

A、总顺乌头酸酶的提取：

称取约 0.1g 组织或收集 500 万个细胞（细菌），加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。将匀浆置于冰上超声波破碎（功率 40%，超声 3 秒，间隔 9 秒，重复 15 次），4℃，11000×g 离心 15min，取上清置于冰上待测（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr1）。用于测定总顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测）。

B、胞浆与线粒体中顺乌头酸酶的提取：

  (1) 称取约 0.2 g 组织或收集 1000 万个细胞，加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。

  (2) 4℃，600×g 离心 5min。（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr2）。

(3) 将上清液移至另一离心管中，4℃，11000×g 离心 15min。

(4) 上清液即胞浆提取物，用于测定胞浆中的顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测）。

(5) 在沉淀中加入 400μL 试剂二与 4μL 试剂三，置于冰上超声波破碎（功率 40%，超声 3 秒，间隔 9 秒，重复 15 次），4℃，5000×g 离心 2min，取上清置于冰上待测。用于测定线粒体中顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测）。

注意：根据实验需要选择性提取细胞总顺乌头酸酶、胞浆乌头酸酶或线粒体乌头酸酶。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至240nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定

（1） 工作液的配制：临用前将试剂五和试剂六加入到试剂四中，充分溶解待用，用不完的试剂 4℃避光保存；

（2） 将工作液 25℃预热 15min 以上；

（3） 在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入：

三、顺乌头酸酶活性的计算 

A、按微量石英比色皿计算：

1、总顺乌头酸酶活性计算：

          （1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N

（2） 按样本质量计算

酶活定义：每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样÷V 提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

（3） 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每 104 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×106]÷（V 样÷V 提取×细胞数量（万个））÷T×N=561.11×ΔA÷细胞数量（万个）×N

V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样： 加入样本体积，0.02mL；V 提取：样本总体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr1：样本蛋白质浓度，mg/mL；106： 单位换算系数，1mmol=1×106nmol；N：稀释倍数。

2、胞浆顺乌头酸酶活性计算：

           （1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

（2） 按样本质量计算