货号:UPLC-MS-4327 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4326 | 规格:50T/48S |
紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
试剂一 |
液体 120 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
液体 50 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 0.6 mL×3 支 |
-20℃保存 |
试剂四 |
液体 25 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂五 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
试剂六 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
试剂三:易挥发试剂,使用后尽快拧紧盖子放入-20℃保存。
顺乌头酸酶(Aconitase, ACO)是细胞内一种重要的铁硫蛋白酶,主要存在于胞浆与线粒体中。ACO 催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸的可逆反应,对维持三羧酸循环及乙醛酸循环的顺利进行起着重要作用。
顺乌头酸酶催化异柠檬酸生成顺乌头酸,顺乌头酸在 240nm 有特征吸收峰,通过检测顺乌头酸的产生速率来计算该酶活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、顺乌头酸酶的提取:(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
A、总顺乌头酸酶的提取:
称取约 0.1g 组织或收集 500 万个细胞(细菌),加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三,用匀浆器或研钵于冰上匀浆。将匀浆置于冰上超声波破碎(功率 40%,超声 3 秒,间隔 9 秒,重复 15 次),4℃,11000×g 离心 15min,取上清置于冰上待测(若以蛋白浓度计算,则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr1)。用于测定总顺乌头酸酶活性(建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测)。
(3) 将上清液移至另一离心管中,4℃,11000×g 离心 15min。
(4) 上清液即胞浆提取物,用于测定胞浆中的顺乌头酸酶活性(建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测)。
(5) 在沉淀中加入 400μL 试剂二与 4μL 试剂三,置于冰上超声波破碎(功率 40%,超声 3 秒,间隔 9 秒,重复 15 次),4℃,5000×g 离心 2min,取上清置于冰上待测。用于测定线粒体中顺乌头酸酶活性(建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测)。
注意:根据实验需要选择性提取细胞总顺乌头酸酶、胞浆乌头酸酶或线粒体乌头酸酶。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至240nm,蒸馏水调零。
2. 样本测定
(1) 工作液的配制:临用前将试剂五和试剂六加入到试剂四中,充分溶解待用,用不完的试剂 4℃避光保存;
(2) 将工作液 25℃预热 15min 以上;
(3) 在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入:
试剂名称(μL) |
测定管 |
工作液 |
180 |
样本 |
20 |
加入样本即开始计时,立即混匀,于 240nm 处测定 10s 时的吸光值 A1,迅速置于 25℃水浴锅或恒温培养箱中准确反应 5min(酶标仪有控温功能的可以将温度调至 25℃),迅速取出比色皿或 96 孔 UV 板并擦干,记录 5min 时的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。 |
酶活定义:每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N
(2) 按样本质量计算
酶活定义:每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 提取×W)÷T×N=561.11×ΔA÷W×N
(3) 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每 104 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 提取×细胞数量(万个))÷T×N=561.11×ΔA÷细胞数量(万个)×N
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:顺乌头酸消光系数,3.6 L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样: 加入样本体积,0.02mL;V 提取:样本总体积,1.01mL;T:反应时间,5min;Cpr1:样本蛋白质浓度,mg/mL;106: 单位换算系数,1mmol=1×106nmol;N:稀释倍数。
酶活定义:每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N
(2) 按样本质量计算
酶活定义:每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 提取×W)÷T×N=561.11×ΔA÷W×N
(3) 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每 104 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 提取×细胞数量(万个))÷T×N=561.11×ΔA÷细胞数量(万个)×N
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:顺乌头酸消光系数,3.6L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样: 加入样本体积,0.02mL;V 提取:胞浆样本总体积,1.01mL;T:反应时间,5min;Cpr2:样本蛋白质浓度,mg/mL; 106:单位换算系数,1mmol=1×106nmol;N:稀释倍数。
酶活定义:每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N
(2) 按样本质量计算
酶活定义:每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 样总×W)÷T×N=244.44×ΔA÷W×N
(3) 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每 104 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1 nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 样总×细胞数量(万个)÷T×N=244.44×ΔA÷细胞数量(万个)×N
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:顺乌头酸消光系数,3.6 L/mmol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样: 加入样本体积,0.02mL;V 样总:线粒体样本总体积,0.404mL;T:反应时间,5min;Cpr2:样本蛋白质浓度,mg/mL; 106:单位换算系数,1mmol=1×106nmol;N:稀释倍数。
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 孔板光径)进行计算即可。
1、 A 大于 1 时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,并在计算时乘以相应的稀释倍数。
2、 当 ΔA 小于 0.01 时,可适当延长反应时间,并在计算时将实际反应时间(T)带入计算公式。
3、 测定蛋白浓度时,由于试剂一本身含有蛋白(约 1 mg/mL)所有测定时需要扣除此部分蛋白。
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