上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4343	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-4342	规格：50T/24S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 1.3 mL 双蒸水充分溶解备用，配好后可分装成小管-20℃保存，可保存两周，禁止反复冻融；

2、 标准品：2 μmol/mL  丙酮酸钠溶液。

产品说明：

LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD+/NADH之间互变。

LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌、细胞或组织样本的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2. 血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、 标准品的制备：取100μL标准液，倍比稀释至1、0.5、0.25、0.125、0μmol/mL，用2、1、0.5、0.25、0.125、0μmol/mL做标准曲线。

3、 样本测定

充分混匀，室温静置 3min，取 200μL 转移至微量玻璃比色皿或在 96 孔板中，450nm 下测定吸光度，计算 ΔA=A

测定管-A 对照管。每个测定管需要设一个对照。

三、LDH 活力单位计算

            1. 标准曲线的绘制：根据标准管测定值和浓度做标准曲线，y为标准品浓度，μmol/mL；x为对吸光度（减去浓度为0的标准管的OD值）。

            2. 计算样本丙酮酸的含量，即将ΔA 带入回归方程中（x），计算y  值。

            3. 血清（浆）LDH活力的计算

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/mL）=y×V样÷V样÷T×103=66.7×y

4. 细胞、细菌和组织中LDH活力的计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/mg prot）= y×V样÷（Cpr×V样）÷T×103=66.7×y÷Cpr

（2） 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/g 质量）= y×V样÷（W÷V样总×V样）÷T×103=66.67×y÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/104 cell）= y×V样÷（500÷V样总×V样）÷T×103=0.133×y

V样：反应体系中加入的样本体积，10μL=0.01mL；V样总：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间，15min； Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；103：1μmol/mL=103nmol/mL。