上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4312	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-4311	规格：50T/24S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂三：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存；

2、 试剂四：临用前取 1 支加入 1.5 mL 试剂一，充分溶解，用不完的试剂 2-8℃保存 2 周。

3、 标准品：1 mmol/L 柠檬酸标准液。临用前用蒸馏水稀释成 250 μmol/L 柠檬酸标准液（将 25μL1 mmol/L柠檬酸标准液和 75μL 蒸馏水混合即可），现用现配。

产品说明：

CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。

酸性条件下，柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样本中柠檬酸含量。

技术指标：

最低检出限：52.09 μmol/L

线性范围：62.5-6000 μmol/L

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、液体样本中柠檬酸提取：取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL，充分混匀，11000g，4℃离心 10min，取上清液， 待测。

2、组织中柠檬酸提取：称约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，11000g，4℃离心 10min，取上清液，待测。

3、线粒体中柠檬酸提取：称约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，600g，4℃离心 5min；取上清至另一EP 管中，11000g，4℃离心 10min，弃上清（此上清液可用于细胞质 CA 含量测定）；向沉淀中加试剂二 200μL，以及试剂三 2μL，充分悬浮溶11000g，4℃离心 10min，取上清液，待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到545nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 试剂一置于30℃水浴中预热30min以上。

3、 操作表（按下表在1.5mLEP管/96孔板管中加入相应试剂）：

三、柠檬酸含量计算

1、按液体样本的体积计算

柠檬酸含量（mmol/L）=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×F

=2.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)

C标准液：标准品的浓度，250μmol/L=0.25mmol/L；F：样本稀释倍数，(0.1mL样本+0.9mL试剂一)÷0.1mL样本=10。

2、按组织质量计算

柠檬酸含量（μmol/g 质量）=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W

=0.25×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W

C标准液：标准品的浓度，250μmol/L；V总：上清液总体积，1.0mL=0.001L；W：样本质量，g。3、按线粒体蛋白浓度计算

柠檬酸含量（μmol/mg prot）=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)] ×V样÷（Cpr×V样）

=0.25×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr

C标准液：标准品的浓度，250μmol/L=0.25μmol/mL；V样：加入的样本体积，20μL=0.02mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL。

注意事项：

1、样本处理等过程均需要在冰上进行。