| 货号：UPLC-MS-4333 | 规格：100T/96S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4332 | 规格：50T/24S | 可见分光光度法 |
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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试剂一 |
液体 60 mL×1 瓶 |
-20℃保存 |
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试剂二 |
液体 0.6 mL×1 支 |
-20℃保存 |
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试剂三 |
液体 5 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂四 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
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试剂五 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂六 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂四：临用前加入到试剂三中溶解待用；
2、 试剂五：临用前加入 4 mL 双蒸水，用不完的试剂仍 4℃保存；
3、 试剂六：临用前加入 3.333 mL 双蒸水，用不完的试剂 4℃保存。
SDH（EC 1.3.5.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。
SDH催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的变化，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表SDH酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4 ℃ 11000g 离心 10min，取上清，置冰上待测。
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定：
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试剂名称（μL） |
测定管 |
空白管 |
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试剂三 |
60 |
60 |
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试剂五 |
60 |
60 |
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蒸馏水 |
800 |
800 |
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37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）保温10min左右 |
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样本 |
30 |
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蒸馏水 |
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30 |
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试剂六 |
30 |
30 |
依次加各试剂到1mL 比色皿中，在加入试剂六的同时开始计时；在600nm 波长下记录20 秒时的初始吸光度A1， 比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中，准确反应 1 分钟；迅速取出比色皿并擦干，600nm 下比色，记录 1 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2，得到 ΔA 测定、ΔA 空白。
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH活性（U/mg prot）=[（ΔA测定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反总×109]÷(Cpr×V样) ÷T=1555.556×（ΔA测定-ΔA空白）÷Cpr
（2） 按样本质量计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH活性（U/g 质量）=[（ΔA测定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T=1571.111×（ΔA测定-ΔA空白）÷W
（3） 按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH活性（U/104 cell）=[（ΔA测定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=3.142×（ΔA测定-ΔA空白）
V反总：反应体系总体积，0.98×10-3L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，21×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.03mL；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
1、 测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性失活。
2、 若ΔA大于0.5，需将酶液用酶提取液稀释，使ΔA小于0.5，可提高检测灵敏度。
3、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
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