货号:UPLC-MS-5080 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-5079 | 规格:50T/48S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 15 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 支 |
4℃保存 |
试剂四 |
液体 2 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 0.25 mL 蒸馏水,充分混匀;用不完的试剂-20℃分装保存两周,避免反复冻融。(1瓶粉剂溶解后可做 100T,为了延长使用时间,此产品多给 1 瓶粉剂)
2、 试剂二工作液:根据试验所需用量,按照试剂二(μL)∶蒸馏水(μL)=1∶29 比例配成工作液,现配现用。试剂二工作液当天配制当天用完。
3、 试剂三:临用前加入 0.6mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂 4℃分装保存两周。
甲醛脱氢酶存在于绝大多数原核生物以及所有的真核生物中,是一种将甲醛进行转换的氧化还原酶。甲醛脱氢酶可催化甲醛和 NAD+产生 NADH,在 340nm 处的吸光值会增加,测定 340nm 处的吸光值变化,可计算得到甲醛脱氢酶的活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
组织:按照动物组织质量(g):提取液体积(mL)=1∶5~10 的比例(建议称取 0.1 g 动物组织,加入 1 mL 提取液),冰浴匀浆,8000 g,4℃条件下离心 10 min;取上清(若上清不够澄清,建议重复上述离心步骤)置于冰上待测。
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。
2、 临用前将试剂一、试剂四置于 37℃预热 10 min。
3、 在微量石英比色皿或96 孔UV 板中依次加入 20 μL 样本、110 μL 试剂一、50 μL 试剂二工作液、10 μL 试剂三、10 μL 试剂四,充分混匀后于 340nm 处测定 20s 时的吸光值 A1,迅速置于 37℃水浴或培养箱 5min(酶标仪有控温功能可将温度调至 37℃),拿出迅速擦干测定 5min20s 时的吸光值 A2。计算 ΔA=A2-A1。
A、按微量石英比色皿计算
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 FDH酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F
2、按样本质量计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
FDH酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×W÷V样总)÷T×F=321.54×ΔA÷W×F
ε:NADH 摩尔消光系数,6220 L/mmol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V反总:反应体系总体积,2×10-4L;V样: 加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W: 样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109 nmol;F:稀释倍数。
将上述公式中 d=1 cm 变为 d=0.6 cm,代入公式进行计算即可。
1、如果测定吸光值 A>1.5 或 ΔA>0.5,建议用提取液稀释样本后再测定,计算公式中乘以稀释倍数;如果测定吸光值较低,建议增加样本量后再进行测定。
2、试剂四有毒性,实验时请佩戴口罩手套等防护用具。
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