苯胺-4-羟化酶(AH)活性检测试剂盒



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货号:UPLC-MS-4609 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4608 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品内容使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致有疑问请及时联系工作人员

试剂名称

规格

保存条件

试剂一

粉剂×2

4℃保存

试剂二

液体 30mL×1

4℃保存

试剂三

粉剂×2

4℃保存

试剂四

粉剂×1

4℃保存

试剂五

液体 11mL×1

4℃保存

试剂六

粉剂×2

4℃保存

试剂七

液体 12mL×1

4℃保存

标准品

液体 1mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂一:临用前取一瓶加入 60mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂 4℃保存可保存 4 周;

2 试剂三:临用前取一瓶加入 6mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,避免反复冻融;

3 试剂四:临用前加入 3mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂 4℃可保存 4 周;

4 试剂六:临用前取一瓶加入 6mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂 4℃密封保存可保存 4 周。

产品说明细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶,在外源物质代谢中具有重要作用,尤其是药物和毒物的代谢。AH P450 酶系中相当于 CYP2E1 亚型,CYP2E1 不仅参与了药物的代谢,而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。AH 催化苯胺羟化后产生的 4-氨基酚,进一步转变为酚-吲哚复合物,在 630nm 处有特征吸收峰;通过测定630nm 吸光度增加速率,来计算 AH 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、超速离心机、水浴锅/恒温培养箱、研钵/匀浆器、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、冰和蒸馏水。

操作步骤

一、粗酶液提取(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、除去细胞核和线粒体等:称约 0.5g 组织,加入 4℃预冷的 1mL 试剂一,冰上充分研磨,10 000g,4℃离心 30min,取上清液,转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体:4℃,100 000g,离心 60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g 离心 30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤 3 的沉淀中加 0.5mL 试剂二,盖紧后充分震荡溶解,即粗酶液,置于冰上待测。

二、测定步骤

1 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 630nm,蒸馏水调零。

2 临用前根据实验用量取出部分试剂二在 37℃水浴中预热 30min。

3 试剂五置于冰浴冷却30min

4 EP 管加入下列试剂:

试剂名称(μL

对照管

测定管

标准管

粗酶液

50

50

-

试剂三

100

100

-

试剂四

-

50

-

蒸馏水

50

-

-

涡旋混匀,置于 37℃恒温培养箱/水浴锅中准确水浴 30min

-

试剂五

100

100

-

涡旋混匀,置于冰浴中 5min11000rpm4℃离心 10min;取上清液待测;

-

上清液

100

100

-

标准溶液

-

-

100

试剂六

100

100

100

试剂七

100

100

100

涡旋混匀,室温静置 30min;取出 200μL 至微量玻璃比色皿/96 孔板中,测定 630nm 下吸光度,分别记 A 对照管、A 测定管、A 标准管;

注:标准管只需测 1-2 次。每个测定管都需设一个对照管。

三、AH 活性计算

(1) 按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃条件下,每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标× V 标×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×F÷(Cpr×V 样)÷T= 2×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷Cpr

(2) 按样本质量计算

活性单位定义:37℃条件下,每克组织每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。AH 活性(nmol/min/g 质量) = C 标×V 标×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×F÷(V 样×W)÷T= 2×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷W

C 标:10μmol/L;V 标:100μL=0.1mL;F:稀释倍数,V 反总÷V 上清液=300μL÷100μL=3;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;V 样:加入粗酶液体积, 50μL=0.05mL W:样本质量,g;T:催化反应时间,30min。

注意事项

1、如果测定吸光值 A>1.5 ΔA>1,建议稀释样本后再测定,计算公式中乘以稀释倍数。

2、如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值,建议增加样本量后再进行测定,注意同步修改计算公式。

3、粗酶液提取后需在当日完成测定。


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