上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购

货号：UPLC-MS-4493	规格：100T/48S	微量法
货号：UPLC-MS-4492	规格：50T/24S	可见分光光度法

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加 6 mL 蒸馏水充分震荡溶解，用不完的试剂-20℃分装保存，禁止反复冻融；

2、 试剂三：临用前加 5 mL 蒸馏水充分震荡溶解；

3、 试剂五：临用前加入 12 mL 蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入 400 µL 浓硫酸（自备），边加边搅拌；

4、 标准品：1 μmol/mL磷标准溶液。临用前将标准液用蒸馏水稀释成0.1 μmol/mL磷标准溶液。

产品说明：

GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。

在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者

增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、浓硫酸和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2、 加样表：

三、GCL活性计算

（1） 按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。

GCL（U/mg prot）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(Cpr×V样)÷T=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷Cpr

（2） 按样本质量计算

活性单位定义：37℃下，每克样本每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。

GCL（U/g 质量）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(W÷V样总×V样)÷T=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷W

（3） 按细胞数量计算

活性单位定义：37℃下，每104个细胞每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。

GCL（U/104 cell）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷细胞数量

（4） 按照液体体积计算

活性单位定义：37℃下，每mL液体每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。

GCL（U/mL）= [ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷V  样÷T=0.0544×ΔA测÷ΔA标

V反总：反应总体积，0.196mL；V样：加入样本体积，0.024 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，15min；C标准液：磷标准溶液浓度，0.1μmol/mL；V样总：加入试剂一的体积，1mL；W：样本质量，g； 细胞数量：以104为单位计算，万个。