上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
| 货号：UPLC-MS-4233 | 规格：100T/48S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4232 | 规格：50T/24S | 可见分光光度法 |
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 50mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂一 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
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试剂二 |
液体 35 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂三 |
液体 35 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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标准品 |
液体 1 mL×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前取 1 支加入 1 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂建议-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；
2、标准品：5μmol/mL 对硝基苯酚溶液。
产品说明：β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、细菌和真菌等生物体，是催化木聚糖类半纤维素降解的关键酶，产物木糖可作为碳源应用于微生物发酵。另外，β-木糖苷酶还可以作为生物漂白剂应用于造纸工业，比传统的漂白法环保，具有广泛的应用价值。
β-木糖苷酶催化对硝基苯酚-β-D-木糖苷产生对硝基苯酚，对硝基苯酚在 405nm 处有特征吸收峰，测定 405nm光吸收增加速率，可计算β-木糖苷酶活性。
需自备的仪器和用品：天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、水浴锅、蒸馏水、超声破碎仪。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、植物样本：称取约 0.1g 样本，加 1mL 提取液，充分冰浴匀浆，然后 12000rpm，4℃，离心 20min，弃沉淀，取 20μL 上清测定蛋白含量，剩余上清作为待测酶液。
2、细菌、真菌样本：收集约 500 万个细胞，加入 1mL 提取液，超声波破碎（冰浴，功率 200w，超声 3 秒，间隔7 秒，总时间 3min）；然后 10000rpm，4℃，离心 10min，弃沉淀 ，取 20μL 上清测定蛋白含量，剩余上清置于冰上待测。
1、 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：用试剂二将标准液稀释至 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL，稀释可参考下表。
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序号 |
稀释前浓度（µmol/mL） |
标准液体积（µL） |
试剂二体积（µL） |
稀释后浓度（µmol/mL） |
|
1 |
5 |
40 |
960 |
0.2 |
|
2 |
0.2 |
500 |
500 |
0.1 |
|
3 |
0.1 |
500 |
500 |
0.05 |
|
4 |
0.05 |
500 |
500 |
0.025 |
|
5 |
0.025 |
500 |
500 |
0.0125 |
|
6 |
0.0125 |
500 |
500 |
0.00625 |
备注：实验中每个标准管需 200µL 标准溶液。
3、 样本测定：
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试剂名称（μL） |
对照管 |
测定管 |
空白管 |
标准管 |
|
酶液 |
200 |
200 |
- |
- |
|
标准品 |
- |
- |
- |
200 |
|
试剂一 |
- |
50 |
- |
- |
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试剂二 |
400 |
350 |
600 |
400 |
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涡旋混匀，置于45℃水浴锅中反应20min |
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试剂三 |
400 |
400 |
400 |
400 |
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涡旋混匀，室温静置5min，测定A405吸光值，分别记为A对照、A测定、A空白、A标准。并计算ΔA测定= A测定- A对照、ΔA标准= A标准-A空白。标准曲线和空白管只需测1-2次。每个测定管需设一个对照管。 |
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根据标准管的浓度（y，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（x，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA 测定（x，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（y，μmol/mL）。
1、按样本蛋白浓度计算
酶活定义：45℃，pH7.4 时，每毫克蛋白质 1min 内催化产生 1μmol 对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性（U/mg prot）=(y×V样)÷(V 样×Cpr )÷T=0.05×y÷Cpr 2、按样本质量计算：
酶活定义：45℃，pH7.4 时，每克样本 1min 内催化产生 1μmol 对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性（U/g 质量）＝(y×V样)÷(W×V 样÷V 样总)÷T=0.05×y ÷W
3. 按细胞数量计算：
酶活定义：45℃，pH7.4 时，每 104 个细胞 1min 内催化产生 1μmol 对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性（U/104 cell）= (y×V样)÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.0001×y
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积，1mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，20min。
注意事项：
1、 吸光度变化应该控制在 0.05-0.6 之间。否则加大样本量或稀释样本，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
2、 样本蛋白质含量需要另外测定。
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