| 货号：UPLC-MS-4223 | 规格：100T/48S | 微量法 |
| 货号：UPLC-MS-4222 | 规格：50T/24S | 可见分光光度法 |
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 50 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂一 |
粉剂×2 瓶 |
-20℃保存 |
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试剂二 |
液体 15 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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试剂三 |
液体 80 mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
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标准品 |
液体 1 mL×1 支 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前取 1 瓶加入 2.67 mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
2、标准品：5 μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。
产品说明：α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α-半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。
α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声破碎仪、1mL玻璃比色皿、研钵/ 匀浆器、冰和蒸馏水。1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 1000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20min，取上清，置冰上待测。
2、组织的处理：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20min，取上清，置冰上待测。
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：将标准液用蒸馏水稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。
3、 标准液稀释可参考下表：
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序号 |
稀释前浓度（nmol/mL） |
标准液体积（µL） |
蒸馏水体积（µL） |
稀释后浓度（nmol/mL） |
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1 |
5000 |
80 |
1920 |
200 |
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2 |
200 |
1000 |
1000 |
100 |
|
3 |
100 |
1000 |
1000 |
50 |
|
4 |
50 |
1000 |
1000 |
25 |
|
5 |
25 |
1000 |
1000 |
12.5 |
|
6 |
12.5 |
1000 |
1000 |
6.25 |
|
7 |
6.25 |
0 |
1000 |
0（空白管） |
备注：实验中每个标准管需 500µL 标准溶液。
4、 样本测定（在1.5mLEP管中依次加入下列试剂）
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试剂名称（μL） |
测定管 |
对照管 |
标准管 |
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试剂一 |
200 |
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蒸馏水 |
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200 |
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试剂二 |
250 |
250 |
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样本 |
50 |
50 |
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迅速混匀，放入37℃水浴锅/恒温培养箱中准确反应30min |
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标准液 |
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500 |
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试剂三 |
1000 |
1000 |
1000 |
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充分混匀，室温静置2min后，于400nm处测定吸光值A，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准曲 线和空白管只需测1-2次。 |
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1、标准曲线的建立：
根据标准管的吸光度（y，ΔA标准）和浓度（x，nmol/mL）建立标准曲线，将ΔA（y，ΔA测定）带入标准曲线中，计算样本生成的产物量x（nmol/mL）。
2、α-GAL活性计算
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg 组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/mg prot)=(x×V 反总)÷(V 样×Cpr)÷T=20x÷Cpr
（2） 按样本质量计算
单位的定义：每g 组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/g 质量)=(x×V 反总)÷(W×V 样÷V 样总)÷T=20x÷W
（3） 按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/104 cell)=(x×V 反总)÷(1000×V 样÷V 样总)÷T=0.02x
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需要另外测定；V反总：反应体系总体积，0.5mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；1000：细胞或细菌总数，1000万； T：反应时间，0.5h。
注意事项：
提取液中含有使蛋白变性的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。
独立公正 方法科学 规范严谨 服务周到
