货号:UPLC-MS-4457 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4456 | 规格:50T/48S | 紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 15 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 1 mL×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前取 1 瓶加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解待用;现配现用,4℃可保存 2 周。
PAL(EC4. 3 1 5)广泛存在于各种植物和少数微生物中,是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶,在动物体内尚未发现。与一些重要的次生物质如木质素、类黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关,在植物正常生长发育、抗病、抗逆反应中起重要作用。
PAL 催化 L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨,反式肉桂酸在 290nm 处有最大吸收值,通过测定吸光值升高速率计算 PAL 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10 分钟,取上清,置冰上待测。
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 290nm,蒸馏水调零。
2、 操作表:(在 EP 管或 96 孔板中按顺序加入下列试剂)
试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管 |
样本 |
5 |
|
试剂一 |
145 |
150 |
试剂二 |
40 |
40 |
混匀,30℃ 准确反应 30min |
||
试剂三 |
10 |
10 |
混匀,静置 10min 后,290nm 处记录测定管吸光值 A1 和空白管吸光值 A2,ΔA=A1-A2。(空白管只需做 1-2 次)
a、用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟使 290nm 下吸光值变化 0.1 定义为一个酶活性单位。PAL(U/mg prot)=ΔA×V 反总÷0.1÷(Cpr×V 样)÷T =13.33×ΔA÷Cpr
(2) 按按样本质量计算
单位的定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中分钟使 290nm 下吸光值变化 0.1 定义为一个酶活性单位。PAL(U/g 质量)=ΔA×V 反总÷0.1÷(V 样÷V 提取×W)÷T =13.33×ΔA÷W
V 样:加入样本体积,5µL=0.005mL;V 提取:加入提取液体积,1mL;V 反总:反应总体积,200µL=0.2mL;T: 反应时间,30min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
(1) 按蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在每mL 反应体系中每分钟使 290nm 下吸光值变化 0.05 定义为一个酶活性单位。PAL(U/mg prot)=ΔA×V 反总÷0.05÷(Cpr×V 样)÷T =26.67×ΔA÷Cpr
(2) 按按样本质量计算
单位的定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟使 290nm 下吸光值变化 0.05 定义为一个酶活性单位。PAL(U/g 质量)=ΔA×V 反总÷0.05÷(V 样÷V 提取×W)÷T =26.67×ΔA÷W
V 样:加入样本体积,5µL=0.005mL;V 提取:加入提取液体积,1mL;V 反总:反应总体积,200µL=0.2mL;T: 反应时间,30min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
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