植物蔗糖酶活性检测试剂盒



产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 60 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 2 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

4℃保存

试剂三

液体 4 mL×1

常温保存

标准品

粉剂×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:用时加入 1 mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂 4℃保存一周;

2 标准品:用时加入 1 mL 蒸馏水充分溶解,制备 10 mg/mL 葡萄糖标准溶液待用;用不完的试剂 4℃保存一周。

产品说明:

蔗糖酶(EC 3.2.1.26)是碳水化合物消化吸收的关键酶之一,能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收。本试剂盒采用3,5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量,由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理

是3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者

增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min  以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。

2、标准品的制备:将标准品用蒸馏水稀释至2.5、2、1.5、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0mg/mL(0mg/mL为空白管)。

3、加样表(在EP管中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL

对照管

测定管

标准管

试剂一

15

15

15

蒸馏水

15

 

 

样本

30

30

 

标准品

 

 

30

试剂二

 

15

15

置于25℃准确水浴 10min

试剂三

30

30

30

混匀,100℃水浴 10min 左右(盖紧,防止水分散失),冷却至室温

蒸馏水

210

210

210

混匀,取 200μL 至微量玻璃比色皿或 96 孔板中测定各管 540nm 吸光值,ΔA=A 测定管-A 对照管。(每个测定管需设一个对照管)

三、蔗糖酶活力计算

1 标准曲线的建立:

以标准品的浓度为 x 轴,540nm 下的吸光度(ΔA 标准=A 标准管-A 空白管) y 轴,绘制标准曲线。根据标准曲线,将∆A(y)带入公式中计算出 x 值(mg/mL)。

2、按照蛋白浓度计算:

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化水解1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。蔗糖酶活力(U/mg prot)=(1000×x×V1)÷(V1×Cpr)÷T=100×x÷Cpr

3、按照样本质量计算:

单位定义:每g组织每分钟催化水解1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。蔗糖酶活力(U/g 质量)=(1000×x×V1)÷(W÷V2×V1)÷T=100×x÷W

1000:1mg/mL=1000μg/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.03mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。

注意事项:

A 大于 1.2 时,建议将样本用提取液稀释后进行测定。


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